乙型脑炎病毒减毒疫苗株sa14-14-2囊膜蛋白氨基酸回复突变株的构建及其对疫苗安全性的影响

乙型脑炎病毒减毒疫苗株sa14-14-2囊膜蛋白氨基酸回复突变株的构建及其对疫苗安全性的影响

急性乙脑病毒（hcl），日本脑炎病毒（jv），是黄色病毒科黄病毒属的成员。这是一种害虫病毒。主要的传播媒体是三对胰肠。它的遗传媒体是一个四相状的个体。它含有约1000颗糖，三种结构蛋白（c、prm和e）和七种非结构蛋白（ns1、ns2a、ns2b、ns3、ns4a、ns4b、ns5）。由于接种减毒活疫苗可以模拟病毒的自然感染过程,1针免疫即可引起强有力的体液免疫和细胞免疫应答,并且免疫力持久甚至可以起到终身保护的作用,具有更大的经济和性能优势。乙脑减毒活疫苗(SA14-14-2株)自1989年获批生产以来,不但用于国内儿童乙脑疾病的预防,而且还出口多个国家。2013年由成都生物制品研究所有限责任公司生产的乙脑疫苗通过了WHO预认证,全球使用量达6亿剂以上,未发生任何严重不良反应的报道1材料和方法1.1病毒疫苗一室提供乙脑减毒疫苗株SA14-14-2由成都生物制品研究所有限责任公司(简称成都公司)病毒疫苗一室提供;乙脑野毒株SA14由成都公司病毒疫苗研究室提供。1.2细胞幼小仓鼠肾(BHK21)细胞由成都公司病毒疫苗研究室提供;原代地鼠肾(PHK)细胞由成都公司病毒疫苗一室提供。1.3实验动物17~19日龄无特殊病原体级(SPF级)昆明种小鼠由成都公司实验动物中心提供。1.4转录试剂及仪器限制内切酶KasI、BglII、XhoI,T4DNA连接酶均购自NEB(北京)有限公司;体外转录试剂盒Ribo-MAXLargeScaleRNAProductionSystem购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。MastercyclerPro梯度PCR仪购自Eppendorf(艾本德)中国有限公司;GenepulserⅡ电转仪购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。1.5rjev264的构建和鉴定1.5.1-14-2和pacnr-3,apos的构建rJEV264的构建采用双质粒系统,将SA14-14-2基因组的5'端序列(1~3446核苷酸)和3'端序列(3446~10976核苷酸)分别插入到质粒载体pACNR,构建成SA14-14-2的两个半分子克隆,分别命名为pACNR-5'JEV和pACNR-3'JEV扩增步骤如下:首先用引物F1、R2扩增片段A,再用引物F2、R1扩增片段B,然后以片段A和B为模板,以F1和R1为引物扩增含E264位点回复突变的片段C,用限制内切酶KasI和BglII酶切后插入到半分子克隆质粒pACNR-5'JEV中,构建成含有E264位点突变的JEV5'半分子克隆质粒p5'E-M264。最后将含有E264位点突变的JEV片段(1~3446)插入到pACNR-3'JEV质粒中,构建成含E264位点回复突变的JEV全长克隆质粒,测序验证全长克隆插入序列的正确性。1.5.2拯救病毒的病毒模型用限制内切酶XhoI酶切线性化上述全长质粒,体外转录获得感染性的RNA转录体,通过电击转染BHK21细胞,大约4d后,待细胞出现明显病变特征(cytopathiceffect,CPE),收获上清,即为拯救的病毒。提取病毒RNA进行RT-PCR,测序验证回复病毒。1.6rjev264的雕刻形态特征和形态分配1.6.1刻蚀的形态特征用含2%灭能新生牛血清的MEM维持液做10倍系列稀释至101.6.2体外取样方法按照接种量MOI=0.001分别将rJEV264和SA14-14-2接种到长满单层PHK细胞的细胞瓶中,每隔24h取样1次,连续取样至120h。按照上述1.6.1项方法测定不同时间点样品的滴度并绘制一步生长曲线,分析E264位点回复突变后在PHK21细胞上增殖特征的变化。1.7大鼠脑内神经毒力和神经侵蚀的测定1.7.1脑内神经毒症为测定rJEV264的小鼠脑内神经毒力,将rJEV264做10倍系列稀释(101.7.2动物死亡率检测为测定rJEV264的神经侵袭力,分别采用0.1mL/只皮下注射(s.c.)、0.5mL/只腹腔注射(i.p.)17~19日龄SPF级昆明种小鼠,以SA14-14-2为对照,每组6只,观察14d,计算小鼠死亡率。1.8统计分析采用SPSS22.0软件进行统计学分析,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1rjev264全球龙的构建和病毒救助2.1.1质粒大小对比琼脂糖凝胶电泳结果显示,rJEV264全长克隆质粒大小为13.5kb,和预期相同,见图1。测序结果显示,构建的E264全长克隆除引入的E264突变位点外,其余序列与SA14-14-2完全一致。2.1.2变特征及变特征模型转染后4d,BHK21细胞出现了明显的细胞病变特征,见图2。测序结果显示,拯救出的病毒E264位点存在预期的回复突变,全基因组序列与全长克隆完全相同,没有发生新的位点突变,见图3。2.2rjev264雕刻特征和生殖特征2.2.1雕刻属性rJEV264蚀斑大小和SA14-14-2基本相同,没有明显差异,两者均明显小于SA14,见图4。2.3大鼠脑内的神经毒力和神经侵略力2.3.1鼠患者典型麻黄性患者脑内注射小鼠7d后,rJEV264组小鼠出现典型的脑炎特征,平均存活天数8.2d。主要表现为萎靡、厌食、毛耸、下肢瘫痪,病毒脑内神经毒力为5.51lgPFU/LD2.3.2rjev214对小鼠发病或死亡的影响结果显示,无论是皮下注射,还是腹腔注射,观察期内rJEV264组小鼠和SA14-14-2对照组小鼠均未出现小鼠发病或死亡情况,见表3。3e64位点回复突变对小鼠神经毒力的影响反向遗传学技术和定点突变技术是研究病毒致病机制或免疫分子基础的主要手段。在本研究中,SA14-14-2E264位点的回复突变可使病毒的小鼠脑内致病力显著增强。但是,蚀斑形态和一步生长曲线显示,rJEV264和SA14-14-2均没有显著区别,表明该位点的回复突变没有改变病毒的增殖能力,脑内神经毒毒力增强可能是由于E264位点的回复突变增强了病毒与宿主细胞的吸附或融合能力。E264位点的回复突变虽然可以导致其小鼠脑内神经毒力的增强,但是无论是皮下注射还是腹腔注射,小鼠均未发病,表明该位点的回复突变并没有增强其对小鼠的神经侵袭力。研究表明,无论是在原代地鼠肾(PHK)细胞,还是在乳鼠脑内传代20次后,该位点均未发生回复突变ARROYO等前期研究发现,E264位点回复突变会显著降低JEV的免疫原性在对SA14-14-2E蛋白的其他5个关键位点(E107、E138、E176、E177、E279)的研究中发现,E138和E107位点的回复突变能显著提高病毒小鼠的神经毒力,是影响乙脑病毒神经毒力最关键的两个位点,并且两个位点之间有很强的协同作用遗传稳定性是减毒活疫苗最重要的检测项目之一,而对疫苗株减毒机制的深入研究是开展遗传稳定性检测的前提。本研究从分子水平上证明了E264位点对乙脑减毒活疫苗安全的重要性,为乙脑减毒活疫苗的质量控制和遗传稳定性标准的建立提供了实验