海藻酸钠固定化α淀粉酶的研究

海藻酸钠固定化α淀粉酶的研究卷,期】2023052023【总页数】5页5845-5849【关键词】海藻酸钠;固定化;α-淀粉酶;聚乙二醇【作者】郑璐;雷明科;张瑞;吴元欣【单位】华中农业高校农业微生物学国家重点试验室,武汉430070;武汉工程高校化工与制药学院,武汉430074;武汉工程高校化工与制药学院,武汉430074;华中农业高校农业微生物学国家重点试验室,武汉430070;武汉工程高校化工与制药学院,武汉430074【正文语种】中文【中图分类】;925+.1α-淀粉酶α-1,4--葡萄糖-葡萄糖苷水解酶普遍存在于动物、植物和微生物中,它能以随机作用的方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的α-1,4葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等,被广泛应用于食品加工、粮食工业、乙醇工业、发酵和纺织业等多种行业,是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一[1,2]。

固定化酶与游离酶相比,具有热稳定性高、保存稳定性好、对变性剂耐受性强等优点,可重复或连续使用,且易于与产品分别,是食品、医药、化工等领域的讨论热点之一[3,4]。

依据酶的性质和用途,酶的固定化方法主要可以分为以下4种:吸附法、交联法、包埋法和共价结合法[5]。

酶的固定化可以使用多种载体,其中海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖,它是由β-1,4--甘露糖醛酸和α-1,4--古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物,其分子含有自由的羧基和羟基,可溶于不同温度的水中,生物相容性好,稳定、无毒、成膜性或成球性好,是常用的囊材与载体材料,也常被用作固定化酶的载体[6]。

聚乙二醇是一种无毒的高分子聚合物,与水有极好的互溶性,它的相对分子质量可从几千到几万,掌握其相对分子质量的大小以及用量,可调整海藻酸钙中孔的尺寸、体积和密度[7]。

以聚乙二醇为海藻酸钠制孔剂,两者在水溶液中形成均一体系,将两者混入***化钙溶液中时,海藻酸钠转化为交联的网状大分子,海藻酸钙形成固态,聚乙二醇可以从固态的海藻酸钙中溶出,即形成多孔结构的海藻酸钙。

当聚乙二醇相对分子质量为4000时,海藻酸钙支架中可形成蓬松匀称的多孔结构,适用于组织工程多孔材料的应用[8]。

本试验采纳海藻酸钠包埋交联法制备固定化α-淀粉酶,得到最佳的固定效果,并对游离酶和固定化酶的酶学性质进行了比较。

采纳聚乙二醇作为制孔剂,为进一步提高固定化α-淀粉酶的酶活性,提高α-淀粉酶的酶学性能供应参考。

1材料与方法仪器与材料试验于2023年5月在武汉工程高校完成。

204型电子分析天平;722型可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司;81-1型加热磁力搅拌器上海司乐仪器厂;-300型多用途水浴恒温振荡器江苏太仓市试验设备厂;-22型电热恒温水浴锅上海精宏试验设备有限公司。

试验中使用的α-淀粉酶购自北京双旋微生物培育基制品厂;聚乙二醇4000购自公司。

其余试剂均购自中国医药集团上海化学试剂公司。

试剂纯度均为分析纯。

方法淀粉溶液多糖含量标准曲线的绘制用法标定淀粉溶液中的多糖含量[9]。

分别取40、60、80、100、120μ2%淀粉溶液,下同,计算多糖含量,稀碘液,用蒸馏水定容至10,混合匀称后在600波长下比色。

以吸光度值为纵坐标,对应多糖含量为横坐标,绘制标准曲线并列出线性回归方程。

α-淀粉酶的固定化取44%海藻酸钠溶液,下同,12%羧***纤维素钠以下简称溶液,下同,22%α-淀粉酶溶液,用蒸馏水定容至10,置于磁力搅拌器上混合匀称,用5注射器吸取上述混合液,以10%戊二醛的2%***化钙溶液,下同中,固定后滤出小球,用蒸馏水洗涤2~3次,储存于4℃冰箱中备用[10]。

α-淀粉酶活力的测定以200μ2%淀粉溶液为底物,加入100μ的1醋酸-醋酸钠缓冲液,400μ蒸馏水,300μ适当稀释的α-淀粉酶溶液,于60℃水浴锅中精确     反应15,马上加入盐酸终止反应。

反应液,加稀碘液,用蒸馏水定容至,混合匀称后在600波长下比色。

固定化酶的活力测定方法是将上述方法中适当稀释的α-淀粉酶溶液替换为肯定量的固定化α-淀粉酶。

在60℃、,以每反应15消耗1多糖的酶量为一个酶活力单位。

酶的相对酶活是指在同一组试验中,以活性最高的一组为100,其余的酶活力与之相比,计算百分数。

单因素试验以固定化酶的相对酶活为考察指标,探讨海藻酸钠浓度、酶浓度、***化钙浓度、浓度对固定化酶活性的影响。

①不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响。

%,浓度为%,***化钙浓度为2%,固定,考察不同浓度的海藻酸钠%、%、%、%对固定化酶活性的影响。

②不同浓度酶对固定化酶活性及固定效率的影响。

当海藻酸钠浓度为2%,浓度为%,***化钙浓度为2%,固定,考察不同浓度的酶%、%、%、%对固定化酶活性的影响。

③不同浓度***化钙对固定化酶活性的影响。

%,海藻酸钠浓度为2%,浓度为%,固定,考察不同浓度***化钙1%、2%、4%、8%对固定化酶活性的影响。

④不同浓度对固定化酶活性的影响。

%,海藻酸钠浓度为2%,***化钙浓度为2%,,考察不同浓度0、%、%、%、%对固定化酶活性的影响。

正交试验在单因素试验基础上,以酶浓度、***化钙浓度、浓度、海藻酸钠浓度4个因素进行934正交试验,以获得最佳固定条件,试验因素与水平见表1。

表1正交试验因素和水平单位:%因素水平***化钙浓度123酶浓度123浓度数据分析采纳-5软件分析固定化酶的直径。

2结果与分析固定化α-淀粉酶的单因素试验不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响分别取浓度为%、%、%、%的海藻酸钠溶液进行试验,结果见图1。

由图1可知,%时,固定化酶活性最大,当海藻酸钠浓度连续增大时,固定化酶活性有所下降,其黏度增大,难以挤压成球状,并且所形成的凝胶小球体积过大,影响酶与底物充分结合。

由图2可知,4种不同浓度海藻酸钠固定化酶的平均直径分别为、、、,即当海藻酸钠浓度渐渐增大时,固定化酶小球的直径随之增大。

产生这一现象的缘由在于当海藻酸钠浓度增大时,单位体积中能与钙离子结合的位点数量也相应增加,进而得到直径较大的固定化酶小球。

图1不同浓度海藻酸钠对固定化酶活性的影响图2不同浓度海藻酸钠对固定化酶形态的影响不同浓度酶对固定化酶活性及固定效率的影响分别取浓度为%、%、%、%的酶液进行试验,结果见图3。

由图3可知,当α-%%时,固定化酶的活性先增高而后趋于稳定,但固定效率却逐步降低。

这主要是由于固定化酶凝胶小球内固定的酶量先渐渐增加而后趋于饱和,过多结合的酶造成酶分子聚集成团,酶分子活性中心可能被部分遮盖,与底物不能充分接触,从而影响固定化酶活性与固定效率。

图3不同浓度酶对固定化酶活性及固定效率的影响不同浓度***化钙对固定化酶活性的影响分别取浓度为1%、2%、4%、8%的***化钙溶液进行试验,结果见图4。

由图4可知,固定化酶活性在***化钙浓度变化范围内先增加而后渐渐降低。

当***化钙浓度为2%时,固定化酶相对活性最高,固定效果最佳。

图4不同浓度***化钙对固定化酶活性的影响4种不同浓度***化钙制备的固定化酶平均直径分别为、、、图5,即当***化钙浓度渐渐增加时,固定化酶的直径随之减小。

推想可能是海藻酸钠中的α-1,4-古罗糖醛酸结构与钙离子交联形成蛋盒-结构,***化钙主要影响的是交联程度,其浓度越高,固定化酶结构的致密程度越高,因此浓度大的***化钙会降低固定化酶的活性与直径。

图5不同浓度***不同浓度对固定化酶活性的影响分别取浓度为0、%、%、%、%的溶液进行试验,结果见图6。

由图6可知,%时,固定效果最佳。

固定化酶活性随浓度的增加渐渐上升,%时,混合液的黏度增加,固定化酶活性降低。

固定化α-淀粉酶的正交试验图6不同浓度对固定化酶活性的影响正交试验结果见表2。

由表2可知,最佳固定化酶的制备工艺为1221,其中各因素影响大小依次为、、、。

利用最佳组合淀粉酶%,***化钙2%,羧***纤维素钠%,海藻酸钠%进行验证试验,%。

可见,优化后的工艺固定效率较高,稳定可行。

表2正交试验结果试验号1234567891111222333123123123123231312123312231固定效率%23固定化酶与游离酶的酶学性质比较对固定化酶与游离酶活性的影响在最佳工艺条件下,取、、、、、、,测定游离酶与固定化酶的活性,试验结果见图7。

由图7可知,,与游离酶相对活性相比,固定化酶的相对酶活变化幅度不大,即固定化酶在变化范围内能够保持相对较高的酶活,相比游离酶具有更宽的适应性。

图7对固定化酶与游离酶活性的影响温度对固定化酶与游离酶活性的影响在最佳工艺条件下,于45~80℃测定游离酶与固定化酶活性,试验结果见图8。

由图8可知,游离酶被固定化以后,其最适反应温度由原来的60℃上升至65℃,当反应温度连续提高时,固定化酶活性明显高于游离酶,这可能是由于固定化载体提高了酶空间结构对热的稳定性。

图8温度对固定化酶与游离酶活性的影响固定化酶与游离酶热稳定性的比较将游离酶与固定化酶分别在60、75、90℃后再测定酶活,以放置在4℃冰箱内的游离酶与固定化酶作为对比,试验结果见图9。

由图9可知,在高温条件下,固定化酶活性损失明显小于游离酶,即使在90℃,其仍能保持33%左右的相对酶活,而游离酶的相对酶活只剩不到10%。

图9固定化酶与游离酶热稳定性的比较不同浓度聚乙二醇对固定化酶活性的影响分别加入浓度为%、%、%、%、%、%、%的聚乙二醇4000制备多孔固定化酶,以不加聚乙二醇的样品作为对比,试验结果见图10。

由图10可知,添加聚乙二醇4000后,固定化酶活性均高于对比,%时,固定化酶活性最高,,明显有利于酶促反应的进行。

游离酶与固定化酶米氏常数的比较利用-作图法以1对1[]作图,根据直线在横轴上的截距-1求米氏常数,结果见图11。

结果表明,,添加聚乙二醇固定化酶的为,而游离酶的为,即不加聚乙二醇的固定化酶对底物的亲和力最小,这与固定化载体的空间障碍与集中限制有关;添加聚乙二醇后,固定化酶形成的多孔结构有利于提高对底物的亲和力,且这2种固定化酶对底物的亲和力均小于游离酶。

图10不同浓度聚乙二醇对固定化酶活性的影响图11游离酶与固定化酶米氏常数的比较3小结本试验采纳海藻酸钠包埋交联法制备固定化α-淀粉酶,探讨了最佳