不同阳春砂栽培类型的性状及活性成分分析

不同阳春砂栽培类型的性状及活性成分分析

杏仁是姜科植物的阳春砂、海南砂和绿壳砂的干燥成熟果实（国家药物委员会，2015年）。砂仁性温、味辛,具有芳香化湿、行气宽中、降气祛痰、温脾止泻和理气安胎等功效(柯斌和师林,2012),在我国有长期的药用和临床使用历史。阳春砂果实春砂仁是传统大宗药材,具有很高的经济价值。据估算,春砂仁产业市场需求应该在100亿元以上,但因亩产量很低使春砂仁供不应求(汤丽云等,2012),而其低产的主要原因是阳春砂自然授粉率低,落果率高。目前阳春砂的栽培类型有长果、圆果和仲华(何国振等,2014),寻找或培育新种质是解决阳春砂单位产量低的根本方法。阳春砂花期气温较低,活动昆虫的种类少,如果阳春砂花期的气温高,活动昆虫种类会增多,因而选育迟花品种,有可能提高授粉率。2010年10月12日,作者在广东省阳春市砂仁试验示范场发现了约3m分子标记技术为品种鉴定提供了形态鉴定外的证据,结合分子鉴定和形态鉴定的结果,可以使品种鉴定更加准确。随机扩增多态性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)是1990年由Williams和Welsh(Williamsetal,1990;Welsh&Mcclelland,1990)发展起来的,是建立在PCR基础上的一种新型的DNA分子标记技术。其基本原理是以随机合成的寡聚核苷酸单链作为引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增,然后检测扩增DNA片段的多态性,这些多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性(唐克轩,2005)。RAPD分子标记技术因其具有分析速度快、操作简单方便、样品需要量少,特异性强等优点,是目前运用最广泛的一类分子标记技术(徐荣和陈君,2006;戴小芬和朱建明,2003)。本研究通过形态鉴定、分子鉴定和化学成分测定,比较疑似新种质与已有的阳春砂各栽培类型和海南砂的差异,以判定是否属于新的栽培类型。1材料和方法1.1“锦秋”和阳春砂实验材料为阳春砂三个栽培类型:长果、圆果和仲华,海南砂,疑似新种质(命名为“锦秋”)。阳春砂和锦秋栽培在广州中医药大学大学城阳春砂试验场,海南砂栽培在距离试验场10m左右的小山坡上。试验场用遮阴网遮阴,海南砂依靠树木遮阴。各种质的田间管理措施相同。1.2叶舌、叶舌长度运用传统生物学观察方法观察砂仁各种质的生物学性状,调查的主要性状及方法如下。用软尺测量从直立茎最下端膨大处至最上端叶片叶鞘与茎连接处的长度。每种种质测量20株植株。随机选取各样品植株,观察每株植株所有叶片的形态,每个样品观察30株植株;取各样品植株的第三片叶,观察叶舌形态,并用软尺测量叶舌长度,测量时从叶舌与叶片连接的侧面的最低点开始,到叶舌最高点为止,每样品测量30个叶舌。选取生长状态一致的五种砂仁种质的植株,观察其根状茎(包括茎尖)的形态、颜色,每个样品观察30条根状茎。1.2.2数据的统计分析根据本实验室已建立的相关体系并参考相关文献(王培训等,2000;徐吉银和丁平,2005),确定PCR反应体系为总反应体系共25μL,其中含有ddHPCR扩增程序:94℃预变性3min,94℃变性1min,35℃(引物为S38),39℃(引物为S655和S207)退火45s,72℃延伸2min,循环40次,72℃再次延伸10min,4℃保存。取扩增产物10μL加上2μL上样缓冲液和1μLGoldViewTM核染色液在1%的琼脂糖凝胶以电压5V·cm对扩增产物选取条带清晰、重复性好的进行记录。根据电泳图谱中标准分子质量,统计反应产物在凝胶上的位置,按凝胶图谱上同一扩增位点条带的有无进行统计,有带的记为“1”,无带的记为“0”。用Ntsys-2.0软件对数据进行处理,得出相应的聚类图和遗传距离表,并进行分析。挥发油含量测定按照中国药典2015版挥发油测定法甲法进行;乙酸龙脑脂含量按照2015版中国药典气相色谱条件进行。利用SPSS20.0软件对数据进行统计和One-WayANOVA方差分析。数据表示为x2结果与分析2.1宏观形态的变化阳春砂的茎分为根状茎和直立茎。根状茎匍匐于地面,直立茎散生,不分枝,基部膨大成球状,是由叶鞘构成的假茎(高江云等,2006)。基部膨大成球状的部分我们称之为芦头。阳春砂植株的高度是指直立茎的高度,我们定义为芦头至最上端叶片叶鞘与茎连接处的长度。五种砂仁种质植株的高度如表1,锦秋植株最高,平均为258.58cm,海南砂最矮,平均为179.22cm。锦秋植株的高度明显高于其他四种种质植株,长果与圆果的没有显著差异。砂仁植株的高度与所处环境的荫蔽度关系密切,荫蔽度大的植株相对较高,而荫蔽度低的植株相对较矮。本文研究的五种砂仁种质植株,其中四种,即长果、圆果、仲华和锦秋生长于荫棚,它们的荫蔽度相对一致,而海南砂生长于树林间,荫蔽度与荫棚的有所不同。因此,从表1的数据不能肯定海南砂比其它四种种质的植株矮,但可以比较的是,锦秋比长果、圆果和仲华的植株高。将五种砂仁种质的第三叶的叶舌进行比较,发现有明显的差异。长果、圆果、仲华和锦秋的叶舌都呈类梯形,而海南砂叶舌为长条形,且质地较薄(图2)。长果、圆果、仲华和锦秋的叶舌前端有凹陷,因而呈波状,但这种现象是随机的。长果和圆果的叶舌最短,海南砂的叶舌最长,仲华和锦秋的叶舌长度介于中间(表1)。长果和圆果叶舌的长度没有显著差异,仲华和锦秋之间的也没有显著差异。如图3所示,五种砂仁种质的根状茎茎尖的形状是相似的,均为锥状,但颜色有差别。锦秋的根状茎尖的颜色与长果、圆果、仲华的一致,均为鲜红色,而海南砂根状茎尖为浅绿色或土黄色,有些甚至是白色。根状茎尖颜色的不同与根状茎的生长习性有一定的关系,长果、圆果、仲华、锦秋的根状茎是在地面生长的,可以接受光照;而海南砂根状茎茎尖有朝地下生长的趋势,往往被落叶等覆盖,不容易接受光照。五种砂仁种质的成熟根状茎的颜色从外表看有差别。长果与圆果根状茎为绿色,包被的褐色鳞片极易脱落;海南砂、仲华根状茎虽然也是绿色,但因为褐色鳞片包裹且不易脱落,因而从表面来看显示出褐色;锦秋根状茎的颜色与仲华和海南砂的类似。五种砂仁种质的小花形态没有明显的差别,碗状的唇瓣扣住假合蕊柱的顶端,假合蕊柱到唇瓣的纵向距离与横向距离在各砂仁种质间目测差别不明显(图5)。表2观察记录了两年的开花物候期,发现五种砂仁种质的开花期有明显的差别,长果和圆果开花最早,仲华和锦秋次之,海南砂开花最迟。2015年长果和圆果的开花时间是4月30日,仲华和锦秋迟了8~10d,而海南砂迟了24d。锦秋和仲华的花期有38~40d,而长果和圆果的花期只有26d,海南砂的也只有30d。锦秋和仲华的盛花期最长,达到29d,而长果和圆果的不到15d,海南砂的处于中间,为20d左右。由于广州市2016年1月出现了寒冷的极端天气,其中24日气温低至0℃,罕见地下了鹅毛雪,使得2016年砂仁的开花时间明显推迟,花期缩短,但五种砂仁种质的花期物候的整个趋势还是与2015年的相似。测量了生长90d处于采摘期的果实大小(表3),结果显示海南砂的果实最大,长果和圆果的果实次之,仲华和锦秋的果实最小。锦秋果实的形状与圆果、海南砂类似,呈胖圆形,其横茎与纵径比大于1;仲华的果实形状显长圆形,其横径与纵径比小于1。五种砂仁种质的果实颜色可以分为两类,长果和圆果果实颜色为红色或红褐色,而仲华、锦秋和海南砂的果实颜色为黑褐色(图6)。所以,锦秋的果实形状与圆果、海南砂相近,而颜色则与仲华和海南砂相近。五种砂仁种质的果实上的果刺形状有差别,锦秋的果刺与仲华、长果和圆果的果刺相似,与海南砂的比较显得尖锐,而海南砂的果刺显得平钝。表4显示,各砂仁种质的百果重和种子千粒重有显著差异。百果鲜重和干重都是海南砂最重,圆果次之,随后为长果,最后为锦秋,这与各砂仁种质的果实大小是相匹配的;然而,各种质果实的干鲜重比却是锦秋最大,海南砂最小,说明锦秋的干物质积累最多。种子千粒重大小以锦秋的最大,长果次之,随后为圆果,最后为海南砂,这与果实的干鲜重比的顺序基本吻合。经过多次重复实验,从91个RAPD随机引物中筛选出3个条带清晰、反应稳定性好、多态性丰富的引物(表5)。用筛选出的3条RAPD引物对五种砂仁种质的DNA进行RAPD-PCR扩增,电泳检测扩增位点共34条,其中多态性位点31条,平均多态百分率为91.2%,RAPD扩增处理的DNA片段多态性丰富。RAPD反应扩增片段主要集中在0.25~3.0kb之间(图7)。根据分子量标准的迁移率确定RAPD带的分子量。RAPD扩增谱带用“1”表示有,用“0”表示无,得到一个二元矩阵。将0—1矩阵在Ntsys-2.0软件中进行处理,得到各品种间遗传相似系数和遗传距离(表6),并获得聚类图(图8)。由表7可以看出,各砂仁种质间的遗传相似度在0.2353~0.9706之间。相似系数越大,遗传距离越小,亲缘关系越近。实验结果表明,遗传相似系数最大的是长果和圆果,其次是仲华和锦秋,说明长果与圆果、仲华与锦秋亲缘关系十分相近,但是各个样品间的相似系数均小于1.0,说明有一定遗传距离,且能用特定的引物可将五种砂仁种质区分,因此这五种砂仁种质是各不相同的。图8聚类分析结果表明,五种砂仁种质可聚为3类:其中海南砂与其它相似系数较小,归为一大类,长果、圆果、仲华、锦秋归为另一大类;在长果这一大类中,仲华和锦秋相似系数较大为一小类,而长果和圆果归为另一小类。因此,锦秋可以归类为阳春砂而不是海南砂,与其遗传关系最近的是仲华。锦秋挥发油含量与长果、圆果或海南砂有显著性差异,其挥发油含量最高(表7)。但除了海南砂达到了2015版《中国药典》规定的种子团挥发油含量不得少于1.0%的要求外,阳春砂长果和圆果均未达到挥发油含量不得少于3.0%的要求,如果锦秋属于阳春砂,则同样未达到药典要求。阳春砂种子团挥发油含量低的原因,一是可能实验条件不合适:由于测挥发油含量前要粉碎种子团,可能粉碎仪器选择不好,导致粉碎过程中损失过多的挥发油;二是可能产地和栽培环境原因导致其不符合药典要求,毕竟广州不是阳春砂的道地产区。但由于各砂仁种质的种子团都是在相同条件下粉碎、提取和测定的,因此其挥发油含量的比较是有意义的。锦秋的乙酸龙脑酯含量与其它四种砂仁种质的相似,相互间无显著性差异(表7)。所有砂仁种质的乙酸龙脑酯含量均未达到2015版《中国药典》规定的不得少于0.90%的要求。这也可能是实验条件或者产地不同等原因造成的。同样,由于在相同的条件下粉碎、提取和检测,因此其乙酸龙脑酯含量的比较仍然是有意义的。3锦秋的形态特征砂仁是我国四大南药之一,其主流品种为春砂仁,最近被广东省列入立法保护的品种。对砂仁特别是阳春砂仁原植物种质资源进行研究,对于中药产业发展具有重要意义。本研究以三种阳春砂栽培类型、海南砂及疑似阳春砂栽培类型(锦秋)为研究材料,从表观形态、遗传距离分析等方面开展砂仁种质资源的鉴定与亲缘关系探讨,以确认锦秋是否为阳春砂新栽培类型,为扩大砂仁种质资源利用打下基础。筛选出的三个引物扩增后,多态性比率为91.2%,显示该物种遗传变异较高。遗传距离显示各个样品间的相似系数均小于1.0,显示有一定的遗传距离,且五种砂仁种质能用特定的引物将它们区分开来,说明五种砂仁种质是有差别的。聚类分析显示样品可分为3类,海南砂聚为一大类;长果和圆果遗传距离最小,可聚为一类;其次是仲华和锦秋,也可聚为一类;相对于海南砂,长果、圆果、仲华与锦秋可总归为一大类。聚类分析结果表明,锦秋是阳春砂,是不同于已知三种栽培类型的新栽培类型。五种砂仁种质形态学指标的比较也支持分子鉴定的结果。锦秋株高明显大于其它三个阳春砂栽培类型。其叶舌的长度介于海南砂和长果、圆果阳春砂之间。锦秋叶缘具有双边波状和单边波状两种现象,而长果、圆果阳春砂都是双边波状叶片,海南砂则是单边波状叶片。因而在叶片形态上,锦秋也表现出处于长果、圆果与海南砂之间。在开花物候方面,锦秋的开花时间也处于长果、圆果与海南砂之间。果实的性状方面比较复杂,锦秋果实的形状为胖圆形,这点与圆果、海南砂相似;颜色为黑褐色与海南砂相近,却与长果、圆果相区别,果实上的果刺形状则与长果、圆果相似。锦秋与仲华的遗传相似系数达到0.8824,除果实形状外的生物学性状指标都相似。其次与长果的亲缘关系较近,推测锦秋是长果和仲华的杂交后代,或者是长果与海南砂的杂交后代。据调查,阳春市砂仁试验示范场于1979年引种海南砂,引种时与长果栽培于同一场址,但分地块单独栽培。1986年后,由于示范场要改种其它经济树,将长果、圆果和海南砂混种于场址的一隅,这地点就是我们于2010年发现锦秋的区域。锦秋的发现是因为它的花期很迟,虽然我们也偶尔在秋天发现长果或圆果开花,但都是极个别的现象,如锦秋般迟花面积达到几平方米的从未发现。然而,当把锦秋移栽到广州市大学城后,没有在秋天发现开花。由于高速公路的建设,原来在阳春市砂仁试验示范场发现锦秋的地点已被破坏,因而也无法重现发现地锦秋的花期。长果和圆果在阳春市的开花期一般早于广州大学城10d左右。因此,锦秋花期的大幅度提前的现象,是一个待研究的课题。锦秋有质量上的优势,虽然其果实小,但种子千粒重最大;由于砂仁的活性成分挥发油存在于种子中,因此锦秋的挥发油含量最高,但其乙酸龙脑酯含量与其它砂仁种质无差异,提示它们间的化学成分组成不同。培育高产品种是解决阳春砂低产问题的根本途径,阳春砂是典型的虫媒植物,只有少数种类的昆虫能为之授粉,培育可接受更多种类的昆虫授粉的品种是一条提高产量的切实可行途径(汤丽云等,2012)。能否接受更多种类的昆虫授粉,与砂仁小花的形态,特别是与其假合蕊柱的挺直程度有关(何国振等,2014)。从形态观察来看,锦秋的假合蕊柱的挺直程度与其它阳春砂栽培类型或海南砂比较没有肉眼可见的差异。海南砂的自然结实率为2%~33%(杨锐培等,2014),而阳春砂的自然结实率为1.1%(彭建明等,2012),两者存在一定的差异,我们推测导致这种差异的原因不是假合蕊柱的挺直程度的不同,而是花蜜量和成分的不同(陈红,2015)。从海南砂的自然结实率略高于长果等阳春砂的结果,推测锦秋的自然结实率会高于长果和圆果,具体情况如何有待将来的实验证实。1.2.1对五种砂仁物质的形态特征的研究1.2.1.1株高测量1.2.1.2叶的形态观察和测量1.2.1.3.根系形态观察1.2.1.4花芽和花束的观察在开花前,选取生长一致的花芽,或于花期选取生长一致的开放的小花,观察花芽或小花形态,每个样品观察30个花芽或小花。1.2.1.5天开花时间的物候观察于开花期间记录五种砂仁种质的始花期、盛花期和末花期。始花期是指某种砂仁种质的花序当天开放数为2花序/10m1.2.1.水果的6种形态于授粉后90d,选取生长状态一致的果实,观察其形态、颜色,并测量其横、纵茎大小,计算横纵比,每个样品观察测量20个果实。1.2.1.百果鲜、干重、种子企业测定于授粉后90d,采摘生长状态一致的五种砂仁种质的果实,测量其百果鲜重;在收获果实后,将果实在50℃下烘干至恒重,测定果实的干重、种子千粒重。实验重复3次。1.2.2.1.提取胎盘中的dna砂仁叶片基因组DNA的提取参照黄琼林和杨锦芬(2010)的CTAB法。1.2.2.2-pcr反应体系的构建以五种砂仁种质的DNA为模板,对S系列中的91个10聚体的