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选修3当代生物科技专项专项1基因工程第1页DNA重组技术基本工具

基础梳理1.基因工程概念基因工程是指按照人们愿望，进行严格设计，通过__________和__________，赋予生物以__________遗传特性，发明出符合人们需要新生物类型和生物产品。基因工程是在__________上进行设计和施工，又叫做__________。DNA重组技术体外DNA重组转基因技术新DNA分子水平第2页2.基因工程基本工具(1)“分子手术刀”——__________①起源：主要是从__________中分离纯化出来。②功能：能够识别双链DNA分子某种__________核苷酸序列，并且使每一条链中__________部位两个核苷酸之间__________断开，因此具有__________性。③成果：经限制酶切割产生DNA片段末端一般有两种形式：__________和__________。专一限制性核酸内切酶（限制酶）原核生物特定特定磷酸二酯键黏性末端平末端第3页(2)“分子缝合针”——__________①两种DNA连接酶（E•coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）比较：a.相同点：都缝合__________键。b.区分：E•coliDNA连接酶起源于__________，只能将双链DNA片段互补__________之间磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合__________，但连接平末端之间磷酸二酯键效率较__________。②与DNA聚合酶作用异同:DNA聚合酶只能将__________加到已有核苷酸片段末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接__________末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶大肠杆菌磷酸二酯黏性末端两种末端低单个核苷酸两个DNA片段第4页(3)“分子运输车”——__________①运载体具有条件a.能在受体细胞中复制并稳定保存。b.具有一至多种限制酶切点，供外源DNA片段插入。c.具有标识基因，供重组DNA判定和选择。②最常用运载体是__________,它是一种裸露、构造简单、独立于__________核区DNA之外，并具有__________双链__________DNA分子。③其他运载体：__________、__________。动植物病毒载体质粒细菌自我复制能力环状噬菌体第5页

一、基因工程概念基因工程别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→体现成果人类需要基因产物归纳整合第6页二、DNA连接酶与DNA聚合酶DNA连接酶与DNA聚合酶都能形成磷酸二酯键，但二者性质各不相同。（1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有核酸片段3′末端羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。（2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上两个缺口同步连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。第7页（3）另外还介绍几个酶①解旋酶：该酶能在DNA复制或转录时破坏DNA碱基对间氢键，从而将双螺旋打开。②DNA水解酶：该酶能催化DNA水解。③RNA聚合酶：该酶能在转录时将单个核糖核苷酸连接成RNA单链。④限制酶：该酶作用是识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。第8页三、基因工程操作工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶2.“分子缝合针”——DNA连接酶第9页3.“分子运输车”——基因进入受体细胞运载体(1)使用运载体目标在基因工程中使用运载体有两个目标：一是用它作为运载工具，将目标基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目标基因进行大量复制。(2)运载体种类目前所利用运载体主要有两类：一类是细菌质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于细菌核区DNA之外双链环状DNA。另一类运载体是噬菌体或某些灭活病毒等。目前人们还在寻找新运载体，如叶绿体或线粒体等也也许成为运载体。第10页

(3)作为运载体必须具有条件：①能复制能在宿主细胞内稳定地保存并大量复制，方便提供大量目标基因②具有多种限制酶切点具有多种限制酶切点，方便与外源基因连接。每种酶切点最佳只有一种，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶单一识别位点，可适用于多种限制酶切割DNA插入③具有某些标识基因具有某些标识基因，方便进行筛选。如大肠杆菌pBR322质粒携带四环素抗性基因，就能够作为筛选标识基因④对宿主细胞无害载体必须是安全，对宿主细胞无害⑤载体DNA大小应合适载体DNA分子大小应合适，方便提取和在体外进行操作，太小就不能操作第11页3.“分子运输车”——基因进入受体细胞运载体一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此必须根据不一样目标和需要，对运载体进行人工改造。目前使用质粒运载体几乎都是通过改造。第12页1．(2023·全国Ⅱ，5)下列论述符合基因工程概念是A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中具有B淋巴细胞中抗体基因B．将人干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，取得能产生人干扰素菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生变化，通过筛选取得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上答案：B第13页2．(2023·浙江理综，2)在用基因工程技术构建抗除草剂转基因烟草过程中，下列操作错误是()A．用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒核酸B．用DNA连接酶连接经切割抗除草剂基因和载体C．将重组DNA分子导入烟草原生质体D．用含除草剂培养基筛选转基因烟草细胞答案：A第14页基因工程基本操作程序

基础梳理基因工程基本操作程序包括：目标基因获取、基因体现运载体构建、将目标基因导入受体细胞及目标基因体现与检测等四个步骤。1.目标基因获取(1)目标基因：__________。(2)原核基因采取__________取得，真核基因通过__________取得。人工合成目标基因常用办法有__________和__________。编码蛋白质构造基因直接分离人工合成反转录法化学合成法第15页(3)PCR技术扩增目标基因①原理：__________。②过程第一步：加热至90～95℃__________；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链合成。2.基因体现运载体构建(1)目标：使目标基因在受体细胞中__________，并且能够__________，使目标基因能够__________。(2)组成：__________＋__________＋__________＋__________DNA解链DNA双链复制标识基因稳定存在遗传至下一代体现和发挥作用目基因启动子终止子第16页1.目标基因获取常用办法：①从基因文库获取目标基因基因组文库（一种生物所有基因）部分基因文库：如cDNA文库（部分基因）②利用PCR技术扩增目标基因原理：生物体外DNA双链复制原理③通过DNA合成仪直接人工合成基因较小，核苷酸序列已知，能够人工合成。

考点归纳第17页启动子终止子目基因标识基因表达载体模式图2.基因体现载体构建目：是使目基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代(关键）第18页①启动子：是一段有特殊构造__________，位于基因__________，是__________识别和结合部位，能驱动基因转录出__________，最后取得所需__________。②终止子：也是一段有特殊构造__________，位于基因__________。③标识基因作用：是为了判定受体细胞中是否具有目标基因，从而将具有目标基因细胞筛选出来。常用标识基因是__________。DNA片段首端RNA聚合酶mRNA蛋白质DNA片段尾端抗生素基因第19页3.将目标基因导入受体细胞(1)转化：目标基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和体现过程。(2)常用转化办法将目标基因导入植物细胞：采取最多办法是__________，其次尚有__________和__________等。将目标基因导入动物细胞：最常用办法是__________。此办法受体细胞多是__________。将目标基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞原因是__________________________，最常用原核细胞是____________________________。其转化办法是：先用__________处理细胞，使其成为__________，再将重组体现运载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定温度下促进感受态细胞吸取DNA分子，完成转化过程。农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术受精卵繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少大肠杆菌Ca2+感受态细胞(3)重组细胞导入受体细胞后，筛选具有基因体现运载体受体细胞根据是__________是否体现。标识基因第20页3.将目标基因导入受体细胞中办法比较生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用措施受体细胞转化过程农杆菌转化法,基因枪法，花粉管通道法显微注射法Ca2＋处理法体细胞受精卵原核细胞目标基因插入Ti质粒T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染色体DNA→体现目标基因体现载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→取得具有新性状动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组体现载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸取DNA分子第21页4.目标基因检测与判定(1)首先要检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目标基因，办法是采取_____________________________。(2)其次还要检测目标基因是否转录出了mRNA，办法是采取_____________________________________。(3)最后检测目标基因是否翻译成蛋白质，办法是从转基因生物中提取蛋白质，用对应抗体进行_________。(4)有时还需进行______________判定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。个体生物学水平DNA分子杂交技术用标识目标基因作探针与mRNA杂交抗原－抗体杂交第22页4.目标基因检测内容和办法比较类型步骤检测内容措施成果显示分子水平检测第一步

第二步第三步个体水平判定目标基因是否插入受体细胞染色体DNA上DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带目基因是否转录出mRNA核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)同上目基因是否翻译出蛋白质蛋白质分子杂交(抗原—抗体之间)同上包括抗虫或抗病接种试验；基因工程产品与天然产品进行活性比较，以确定功能是否相同等第23页总结：二者组成成份及构造基本相同目基因通过转录和翻译表达遗传信息生物共用一套遗传密码基因重组一、基因工程有关原理第24页归纳整合

一、外显子与内含子一般来说，真核细胞基因都是由外显子和内含子组成。原核细胞基因真核细胞基因不一样点编码区连续，无内含子，构造简单编码区有间隔，不连续，有内含子；构造复杂相同点都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息体现核苷酸序列；编码区上游都有与RNA聚合酶结合位点二、原核细胞与真核细胞基因构造比较第25页基因工程应用及生物技术安全性

基础梳理1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物__________。2.动物基因工程：提升动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产__________。3.基因治疗：_______________导入病人体内，使该基因体现产物发挥作用。把正常外源基因品质药品第26页二、植物基因工程与动物基因工程成果外源基因类型及举例成果举例抗虫转基因植物抗虫基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米抗病转基因植物抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因抗真菌基因：几丁质酶基因抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒抗逆转基因植物抗逆基因：渗入压调整基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因抗盐碱和抗干旱烟草、抗寒番茄、抗除草剂大豆和玉米第27页外源基因类型及举例成果举例改良品质转基因植物优良性状基因：提升必需氨基酸含量蛋白质编码基因、控制番茄成熟基因、与花青素代谢有关基因高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛提升生长速度转基因动物外源生长激素基因转基因绵羊、转基因鲤鱼改善畜产品品质转基因动物肠乳糖酶基因乳汁中含乳糖较少转基因第28页外源基因类型及举例成果举例生产药品转基因动物药用蛋白基因+乳腺蛋白基因启动子等调控组件转基因动物具有乳腺生物反应器作器官转移植供体转基因动物将外源抗原决定基因体现调整因子导入到器官供体基因组或除去供体抗原决定基因无免疫排斥反应转基因猪第29页1．安全性问题 (1)食物安全面：也许合成出毒蛋白，出现新过敏原，变化食物营养成份。 (2)生物安全面：有也许造成“基因污染”，危害生物多样性。 (3)环境安全面：有也许打破物种界限，变化生态系统能量流动和物质循环；造成二次污染或产生出危害动、植物和人类生物或产物。转基因生物安全性问题

第30页2．转基因生物存在安全性原因 (1)目前对基因构造、调控机制及基因间互相作用理解有限； (2)目标基因往往是异种生物基因； (3)外源基因插入宿主基因组部位往往是随机。第31页3．理性看待转基因生物 (1)转基因生物优缺陷分析优点缺点1.处理粮食短缺问题2．减少农药使用，减少环境污染3．增加食物营养，提升附加值4．增加食物种类，提升食物品质5．提升生产效率，带动有关产业发展1.也许产生新病毒或新过敏原2．也许产生抗除草剂杂草3．也许使疾病传输跨越物种障碍4．也许会损害生物多样性5．也许干扰生态系统多样性(2)看待转基因生物正确态度是趋利避害，不能因噎废食。第32页严禁生物武器

基础梳理1.种类：致病菌、病毒、生化毒剂，以及通过__________致病菌。2.散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等。3.特点：__________、多数具__________、传染途径__________、污染面__________、__________、__________、__________等。4.__________生物武器条约及中国政府态度。(103)严禁基因重组致病力强传染性多广有潜伏期不易被发觉危害时间长第33页归纳整合一、基因诊断与基因治疗1.基因诊断(1)原理：DNA分子杂交。(2)过程：制备用放射性同位素（如32P）、荧光分子等标识DNA（患者DNA）分子作探针；将待测DNA制成单链；让二者进行杂交，若二者能进行互补配对，则说明患有此病，不然不患此病。2.基因治疗---治疗遗传病最有效伎俩。(1)原理：把正常外源基因导入有基因缺陷细胞中，达成治疗疾病目标。病人细胞中现有缺陷基因，也有正常基因。第34页(2)办法：体外基因治疗和体内基因治疗。(3)体外基因治疗：先从病人体内取得某种有关细胞，进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移细胞扩增培养，最后重新输入患者体内，这种办法叫做体外基因治疗。例如：复合型免疫缺陷症。(4)体内基因治疗：直接向人体组织细胞中转移基因治疗办法叫做体内基因治疗。举例：基因治疗过程（以镰刀型细胞贫血症治疗为例）第35页举例：基因治疗过程（以镰刀型细胞贫血症治疗为例）步骤过程获取正常血红蛋白基因用限制性核酸内切酶从人DNA分子中切取血红蛋白基因形成重组运载体用同一种限制性核酸内切酶在运载体DNA上切开一种切口，用DNA连接酶将正常血红蛋白基因连接在运载体DNA上，形成重组运载体重组运载体转化与筛选将携带正常血红蛋白基因重组运载体导入患者造血干细胞中，并将重组运载体插入到染色体。用选择培养基筛选出含重组质粒造血干细胞将含正常血红蛋白基因造血干细胞回输给患者骨髓将携带正常血红蛋白基因造血干细胞输入患者骨髓中，此造血干细胞产生含正常血红蛋白红细胞，以根治镰刀型细胞贫血症成果：健康基因体现掩盖了缺陷基因体现。第36页说明：对于遗传病治疗，最主线办法是进行基因替代或修复。基因治疗最佳时期理论上是受精卵时期，这样能够使个体每个细胞都具有正常基因，但在现实生活中是不也许，由于不也许人人都在受精卵时期进行基因检查。其次是对患者进行有关细胞基因替代，如对于遗传性糖尿病患者，只对胰岛B细胞进行基因替代，该个体就能正常分泌胰岛素，糖尿病得以治疗。但这种局部细胞基因替代，并没有变化其他部位细胞基因，如精原细胞等，因此，患者后裔很也许还会患遗传性糖尿病。第37页基