糖尿病心肌病模型的建立

糖尿病心肌病模型的建立

糖尿病是糖尿病心肌病的重要原因。糖尿病心肌病严重威胁着糖尿病患者的生活健康。自Hayat等当前,糖尿病心肌病的动物模型有:(1)自发性模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠、GK大鼠和OLETF大鼠等;(2)诱发性模型,如单纯高糖高脂饮食(highfatdiet,HFD)、一次大剂量腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、多次小剂量腹腔注射STZ和HFD结合腹腔注射STZ等材料和方法1小鼠饲养及管理5~6周龄C57BL/6J雄性小鼠,购于解放军总医院医学实验动物中心,动物质量合格证编号为No.11400700164757。小鼠饲养于解放军总医院医学实验动物中心,SPF级。室温保持在20~26℃,湿度为0.4~0.7,每天12h昼夜循环(光照时间为7:00AM~7:00PM),自由进食水。造模实验开始前,适用性饲养1周。所有操作均符合解放军总医院实验动物福利伦理委员会的要求。2饲料及stz、柠檬酸、柠调整酸钠高脂饲料购于ResearchDiets;普通饲料购于北京斯贝福公司;STZ、柠檬酸和柠檬酸钠均购于Sigma;40g/L多聚甲醛购于北京索莱宝公司。3实验方法3.1小鼠饲料及饲料的制备将40只小鼠随机分成2组:对照组(control组)和HFD+STZ组,每组各20只小鼠。Control组以普通饲料喂养;HFD+STZ组以高脂饲料喂养4周后,禁食不禁水约12h,以100mg/kg的剂量腹腔注射STZ(100g/L溶于柠檬酸缓冲液),control组小鼠腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液3.2空腹血糖检测分别于造模实验开始(0周)、5周、6周、11周和16周,禁食不禁水约12h后称重,取鼠尾血用血糖仪测量空腹血糖值(fastingbloodglucose,FBG)。以空腹血糖值>13.89mmol/L认为2型糖尿病小鼠造模成功3.4elisa测试取小鼠眼球血离心得到血清,用小鼠胰岛素检测试剂盒(ALPCO)检测血清胰岛素水平。3.5组织切片,苏-伊红染色取小鼠心肌组织用40g/L多聚甲醛溶液固定8~12h,石蜡包埋,组织切片,苏木素-伊红染色。用荧光显微镜(Olympus)观察,分析心肌的病理形态情况并定量,随机选取的小鼠心肌相似截面,并从心肌切片截面上随机选取10个心肌细胞,计算其平均值,定量分析心肌细胞面积。3.6小鼠心肌凋亡水平取小鼠心脏组织用40g/L多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,组织切片,60℃孵化15min,脱蜡,再水化。小鼠心室肌细胞的凋亡水平使用TUNEL检测试剂盒(Roche)检测。用荧光显微镜观察,进行图像分析和定量,用Image-ProPlus软件在切片截面上进行细胞计数,计算心肌细胞凋亡率。4组间多重比较t-tod统计软件采用SPSS17.0。数据以均数±标准差(mean±SD)或均数±标准误(mean±SEM)表示。组间多重比较行单因素方差分析后采用SNK-q检验或Tamhane’sT2检验,进行各组均数间两两比较;两独立样本比较选用t-test。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1小鼠体重和hfd+stz评分的变化各组小鼠在造模过程中的体重变化情况显示,经过4周高脂饲料喂养后,HFD+STZ组小鼠相对于control组体重增加(P<0.05);注射STZ1周后HFD+STZ组小鼠体重略有下降,但仍比control组高(P<0.05);造模第11周和第16周,小鼠体重持续增加,与control组相比均有显著差异(P<0.05),见图1。2造模前后血糖的变化在造模过程中小鼠的空腹血糖变化情况示,control组小鼠血糖值较为稳定;经过4周高脂饲料喂养后,HFD+STZ组小鼠相对于control组血糖有所增加(P<0.05),但未达到13.89mmol/L,注射STZ1周后HFD+STZ组血糖显著增加(>13.89mmol/L),造模第11周血糖继续增加,第16周血糖较之前比略有下降,但仍高于13.89mmol/L。造模第6、11和16周小鼠的血糖与同时期control组相比均有显著差异(P<0.05),见图2。3小鼠血清胰岛素水平ELISA检测显示,在造模第11周和16周时,HFD+STZ组小鼠与同时期正常对照组相比血清胰岛素水平均降低(P<0.05),见图3。4小鼠血清中hfd+stz、mve/apos的变化于造模第11周和第16周分别选择control组和HFD+STZ组进行心功能检测,结果见表1。造模第11周,HFD+STZ组小鼠与control组相比,E'/A'增大(P<0.05),其它指标变化不明显;造模第16周,HFD+STZ组小鼠与control组相比,E'/A'和MVE/E'增大(P<0.05),CO、LVEF和LVFS减小(P<0.05)。5小鼠心肌组织结构小鼠心肌组织切片HE染色观察和定量分析显示,造模第16周,HFD+STZ组小鼠心肌组织结构中可见心肌细胞明显肥大,心肌细胞面积明显大于同时期control组(P<0.05);与造模第11周时control组相比,同时期HFD+STZ组小鼠心肌细胞面积变化不明显,见图4。6小鼠心肌细胞凋亡率小鼠心肌细胞凋亡分析显示,在造模第16周时,HFD+STZ组小鼠心肌细胞凋亡率明显大于同时期control组(P<0.05);与造模第11周时control组相比,同时期HFD+STZ组小鼠心肌细胞凋亡率变化不明显,见图5。型糖尿病心肌病小鼠模型的建立2型糖尿病约占所有糖尿病患者的90%以上,并且有证据显示60%~75%的血糖控制良好且无其它并发症的2型糖尿病患者被证明存在舒张期功能障碍,其中28%发展为伴左心室充盈压增高的舒张功能严重受损目前,采用连续高脂饮食结合单次腹腔注射低剂量STZ的方法建立2型糖尿病小鼠模型的研究已较为成熟2型糖尿病患者随病程的延长会出现不同程度的心肌舒缩功能异常,其中左室舒张功能的异常较早出现。临床上超声心动图、核素显像等检查发现糖尿病心肌病患者在出现心功能障碍时,主要表现为射血分数降低和峰充盈率降低等变化。2型糖尿病患者的代谢紊乱会导致广泛的心肌损害,表现为心肌细胞肥大、变性、灶性坏死等。鉴于20周龄db/db小鼠出现明显心脏功能障碍采用连续HFD结合单次腹腔注射低剂量STZ的方法建立2型糖尿病心肌病小鼠模型有许多优势。(1)其相较于单纯HFD诱导小鼠模型的造模时间较短,有研究显示采用单纯HFD饲养大于24周才能复制出2型糖尿病心肌病小鼠模型综上所述,采用连续喂养HFD结合单次注射S