动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座

2.2动物细胞工程生产单克隆抗体等

动物细胞工程惯用技术动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合是其它动物细胞工程技术基础。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第1页一.动物细胞培养怎样进行细胞培养?2.2.1动物细胞培养和核移植技术从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜培养基中，让这些细胞生长和增殖。(一)概念

阅读P44-P45页回答下列问题问题1：试说动物细胞培养大致过程、原理动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第2页(二)动物细胞培养过程胚胎或幼龄动物器官、组织细胞悬液10-50代细胞剪碎胰蛋白酶或胶原蛋白酶胰蛋白酶处理分瓶培养原代培养动物细胞培养不能最终培养成生物体细胞增殖迟缓，核型可能改变贴壁生长接触抑制10代以内，保持正常二倍体核型传代培养单个细胞培养液原理：有丝分裂动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第3页问题4：为何用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理？问题2：、为何选取动物胚胎或幼龄个体器官或组织做动物细胞培养材料？因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。问题3、为何培养前要将组织细胞分散成单个细胞？分散成单个细胞、细胞群（团）后轻易培养，细胞所需营养轻易供给，其代谢废物轻易排出动物组织细胞间隙中含有一定量弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，能够使动物组织细胞间蛋白质和细胞外其它成份酶解，取得单个细胞。

问题5：为何用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？动物细胞培养最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4动物细胞培养中无活性。问题6：用胰蛋白酶处理不会把所培养细胞消化掉吗？控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第4页

当原代培养细胞处于接触抑制后,用胰蛋白酶处理,使细胞从瓶壁上脱离下来,然后加入新培养液,将细胞分离稀释,并从原培养瓶内转接到新培养瓶内,这个过程称传代培养.（分瓶培养过程）②传代培养①原代培养定义：人们通常将动物组织消化后首次培养称为原代培养。强调一：原代培养与传代培养动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第5页细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养（普通）传代培养原代培养和传代培养、细胞株和细胞系（了解）▲细胞株：传代细胞普通能传到40-50代，遗传物质普通不会发生改变，叫细胞株。▲细胞系：传代50代以后，部分细胞遗传物质发生了改变，能无限增殖，取得不死性，叫细胞系。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第6页强调二：细胞贴壁过程■细胞贴壁：在培养瓶悬液中分散细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。■培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第7页■当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞就会停顿分裂增殖，这种现象称为细胞接触抑制。强调三：接触抑制动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第8页

多细胞动物和人体细胞都生活在内环境中，依据你所学内环境知识，思索以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？

2.体外培养细胞需要什么样环境条件？

P46讨论充分营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成份及血清、血浆等天然成份。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第9页(三)动物细胞培养条件P461、无菌、无毒环境（无菌处理和添加抗生素目标？更换培养液好处？）2、营养:与体内相同，液体合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、水、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成份。3、温度和PH4、气体环境95%空气、5%CO2--维持培养液PH适宜温度：人和哺乳动物细胞最适温度为36.5±0.5℃。适宜酸碱度：PH：7.2-7.4动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第10页动物细胞培养液主要成份是什么？较植物组培培养基有何独特之处？主要成份：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成份中有动物血清等动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第11页P47最上面1、大规模生产生物制品。2、培养动物细胞作为基因工程受体细胞。3、检测判断物质毒性。4、培养正常或各种病变细胞，用于生理、病理、药理等方面研究，如用于

等，为

及其它疾病提供理论依据。(四)动物细胞培养技术应用筛选抗癌药品治疗和预防癌症动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第12页植物组织培养和动物细胞培养比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞全能性细胞增殖培养基性质固体培养基液体培养基培养基特有成份蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目标快速繁殖、培育无病毒植株取得细胞或细胞分泌蛋白动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第13页我收获了什么？动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第14页背诵1、动物细胞培养过程、注意问题2、动物细胞培养条件、注意问题3、动物细胞培养和植物组织培养比较动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第15页动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第16页相互接触接触抑制单层胰蛋白酶衰老或死亡不死性降低降低动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第17页活细胞膜含有选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。中低温新陈代谢酶抗原动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第18页二.动物细胞核移植技术和克隆动物将动物一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新胚胎，这个新胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性轻易

细胞分化程度高，恢复全能性不轻易(一)、动物细胞核移植概念：动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第19页动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第20页(二)、体细胞核移植过程：请看教材P48图2-21思索：1.核移植受体细胞是什么？处于什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？2.经过什么伎俩激活受体细胞，构建重组胚胎？MⅡ中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需营养；含有激活细胞核表达全能性物质。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第21页(二)、体细胞核移植过程：动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第22页P49讨论：1.在体细胞细胞核移植到受体卵母细胞之前，为何必须先去掉受体卵母细胞核？为使核移植胚胎或动物遗传物质全部来自有主要利用价值动物提供体细胞，在供体细胞细胞核移至受体细胞之前，必须将受体细胞遗传物质去掉或将其破坏(P49小资料）。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第23页培养动物细胞普通当传代至10～50代左右时，部分细胞核型可能会发生改变，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内细胞普通能保持正常二倍体核型。所以，在体细胞核移植中，为了确保供体细胞正常遗传基础，通常采取传代10代以内细胞。2.用于核移植供体细胞普通都选取传代10代以内细胞，想一想，这是为何？动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第24页3.你认为用上述体细胞核移植方法生产克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%复制吗？为何？绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少许DNA，即线粒体中DNA是来自于受体卵母细胞。另外，即便动物遗传基础完全相同，但动物一些行为、习性形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活环境与克隆动物所生活环境不会完全相同，其形成行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%复制。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第25页(三)、体细胞核移植技术应用前景：1、在畜牧业中能够加速家畜遗传改良进程2、保护濒危物种3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官移植4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病发展过程和治疗疾病动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第26页阅读书本P50页(四)、体细胞核移植技术存在问题：动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第27页思索与探究1.幼龄与老龄动物组织细胞比较，分化程度低与分化程度高组织细胞比较，哪一个更易于培养？思索一下，这是什么道理？

提醒：细胞衰老与动物机体衰老有着亲密关系，细胞增殖能力与供体年纪相关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，普通来说幼年动物组织细胞比老年动物组织细胞易于培养。一样，组织细胞分化程度越低，则增殖能力越强，所以更轻易培养。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第28页思索与探究2.动物细胞培养要经过脱分化过程吗？为何？动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时脱分化过程了。要想使培养动物细胞定向分化，通常采取定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要组织或器官。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第29页3.1997年，美国威斯康星州一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量普通为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。能够。卢辛达产奶量很高，有高产奶遗传基础，利用卢辛达体细胞克隆奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛含有高产遗传基础，假如精心培育和喂养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产公牛自然繁殖，可得到很多高产后代，从而加紧奶牛改良进程。该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限繁殖，以防止奶牛群出现近亲繁殖而引发种质衰退。动物细胞培养和核移植技术专业知识专家讲座第30页（2）假如将克隆高产奶牛卢辛达任务交给你，你将怎样对它进行克隆