色层分离法课件

色层分离法1/782/78概述历史1923年俄国植物学家MichaelTswett初次发觉层析法色谱法层离法石油醚3/78色层分离基本原理色层系统组成固定相流动相固定不动物质称作固定相(固体或液体)推进固定相上待分离物质朝着一种方向移动液体、气体4/78

气－固气固色层分离法按流动相分类色谱分离法气相色谱液相色谱

气－液气液色层分离法

液－液液液色层分离法

液－固液固色层分离法5/78利用混合物中各组分物理化学性质差异使各组分在两相中分布程度不一样，从而使各组分以不一样速度移动而达成分离目标。吸附力分子形状及大小分子亲和力分派系数色层分离基本原理性质6/78色层分离法基本原理7/78层析分离分类按溶质分子与固定相互相作用机理吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力）分派层析（溶质在两液相间分派系数不一样）凝胶过滤（分子大小与形状）亲和层析8/78层析分离分类按操作形式不一样分类：柱层析：纸层析：薄层层析：9/78柱色谱：在一根玻璃管或金属管中迸行色谱技术。

纸色层：滤纸吸附水作固定相，有机溶剂作流动相。薄层色谱：把吸附剂粉末舖成薄层作为固定相。10/7811/78纸色层微量操作技术，简、分离效率高、但分离速度慢１、基本原理纸色层－纸上萃取色谱，它和萃取同样，它也是根据不一样物质在两相间分派比不一样而进行分离（相称于逆流萃取）。12/78123456731.层析缸2.滤纸3.原点4.展开剂5.前沿6.7.斑点13/78yxRf计算2.比移值Rf组份分离后,它们在滤纸上位置用比移值Rf表达.[定义]:14/78Rf大小取决于溶质在二相间分派系数及滤纸性质.不一样组分具有不一样分配系数,因而也就有不一样Rf.这就是定性根据.3.影响Rf原因(1).欲分离物本性:物质在两相分派系数,决定了它Rf大小;15/78(2).层析溶剂:同一组分在不一样溶剂中Rf不一样。一般应选这样层析剂，使溶质Rf在0.05

0.85之间,不一样组分Rf差值>0.05.(3).pH:影响它们存在状态(4).滤纸:质地均一、厚薄合适、具有一定机械强度、不含杂质16/78(5).温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质分派系数及流动相扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超出±0.5oC(6).展开方式:展开方式不一样,Rf也不一样。下行法Rf最大，上行法Rf较小，环行法Rf也不大。17/78上行法

将点有试样滤纸条下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3~4cm时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）18/78对于Rf十分接近物质可采取连续挥发色谱法纸条上端暴露在层析缸外，方便令上升溶剂挥发；b.只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不停地上升而挥发，展层过程就自动连续地进行；19/78c.若溶剂沸点＞100oC，则可在纸条暴露部分用红外灯烘烤，促使溶剂挥发；d.该法不能测量前沿，但可达分离目标。b.下行法溶剂自纸上端向下降（借助于重力作用），具有分离速度快及连续挥发色谱长处。20/78操作技术(1).滤纸(担体)滤纸选择a.要求滤纸质地均匀、平整无折痕边缘整洁b.要求滤纸纤维松紧合适c.滤纸杂质含量少

21/78固定相纸层析－以吸着在纤维素上水作固定相。反相纸层析－用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。(2).试样A.试样溶解尽可能避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最佳采取与展开剂极性相同溶剂。液体样，直接点样。22/78(3).点样办法a先用铅笔在距纸条一端2~3cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表达点样位置；见下示意图：23/78b.点样工具：微量注射器、毛细滴管（Φ＝0.5mm)；c.点样办法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样斑点直径为0.2~0.5cm,每次点样2~20μl于滤纸上，以冷风吹干；d.干后，将纸两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。24/78(4).展开A.展开剂展开剂选择：欲分离物在两相中溶解度；展开剂极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中分派系数最佳不受温度影响欲分离物在两相间分派平衡瞬间达成25/78(5).显色展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号a.有色物：直接观测各个色斑无色物：物理法显色：用紫外灯照，观测有没有吸取或发出多种不一样颜色荧光斑点，并用铅笔画下斑点位置及大小。26/78(6).分析定性：［试验条件］，各物质有各物质Rf。为了查明未知物组成，最佳是在同样条件下与已知纯物质做对照试验化学法显色：利用多种物质特性反应，喷洒合适显色剂，若被分离物质具有羧酸，可喷酸碱批示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离物质具有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其他化合物所用显色剂可从手册里查阅。27/78xyRf=x/yRf计算:28/78定量剪洗法：将斑点剪下，用合适溶剂洗脱，然后用多种仪器办法（如红外、紫外、原子吸取、发射光谱），也可将斑点剪下灰化，再用合适溶剂溶解，测之。比较法：经纸色谱将多种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其也许含量。反射散射光谱法：

29/78(7).应用例１．氨基酸分离（固定相为水）流动相分离情况正丁醇：2mol/LHAc=1:1酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和苄醇亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水＝16:16:0.1:3.9亮氨酸、异亮氨酸30/78流动相分离情况２－丁醇：醋酸：水＝32:2:22甲状腺素、二碘酪氨酸流动相１：丁醇：HAc:H2O=4:1:5流动相２：M－甲酚－酚：pH=9.33硼酸缓冲液=1:1亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等31/78第二部分、薄层色谱法原理和特点[原理]:当展开剂从薄板上固定相空隙中通过时,由于各组分K不一样和足够数次分派.[特点]:装置简、操作方便展开时间短样品负荷量大、斑点扩散少32/78[缺陷］：Rf值反复性差[克服措施］：标样和试样在同一块板上展开同一张色谱图可用不一样试剂显斑，也可用浓硫酸等强氧化剂或在400~500ｏＣ加热碳化检出33/78吸附剂（固定相）决定吸附性能原因：吸附剂化学组成、活性、表面积［要求］：合适吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反应粒度细小并且均匀（范氏方程，减少涡流扩散项）34/78(1).氧化铝氧化铝呈薄弱碱性，酸性较强化合物在氧化铝上吸附很牢（因此，酸性物质分离不好），故一般用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定中性物质、碱性物质。一般要求薄板用活性为Ⅱ~Ⅲ级

氧化铝活性与含水量密切有关（含一定量水份时，吸附剂表面吸附中心回被水分子占据）35/78活性ⅠⅡⅢⅣⅤ含水量（％）０３６１０１５故加热驱除水－活化；加入一定量水－失活Δ100~150oC,除去Al2O3中与羟基结合部分水份，使Al2O3有一定活性Δ150~300oC，Al2O3活性达Ⅱ～Ⅲ级Δ300~400oC，Al2O3活性达Ⅰ～Ⅱ级Δ>600oC，Al2O3深入脱水并开始烧结36/78

由于脱水过程受到许多原因影响，因此，每批生产Al2O3，其表面积和表面孔穴构造并不一致，活性也不相同。37/78市售供薄层色谱用Al2O3有:Al2O3－H氧化铝中无粘合剂Al2O3－G氧化铝中含煅石膏（一般5％煅石膏）［煅石膏CaSO4，作为粘合剂］Al2O3－HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光批示剂（在254nm下呈黄绿色荧光）Al2O3－GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光批示剂（在254nm下呈黄绿色荧光）上述商品能够直接调料涂敷（1份料，2份水调合）38/78硅胶构造为:(2).硅胶39/78

薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）、硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光物质硅胶）硅胶GF254（具有煅石膏和荧光剂）

另外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。40/78３．展开剂（流动相）

展开剂洗脱作用实质是展开剂分子与欲分离组分竟争占据表面吸附中心过程。强极性展开剂分子占据吸附中心能力强，因此，有强洗脱作用，非极性展开剂分子占据吸附中心能力弱，因此，有弱洗脱作用。（1）常用展开剂极性：石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸41/784.操作技术（1）制板玻璃板a.平整、去油、去污（可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）b.玻璃板尺寸根据自己需要自由选择，小可用2.57.5cm载玻片,大可用2020cm玻片。42/78涂布液取一定量吸附剂放入研钵中，加入需要水或合适溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽雪白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述办法涂布。涂布办法玻棒涂布：43/78玻片刮涂倾斜涂布（利用流平性）-简，但均匀性差涂布器活化薄板首先风干，不然湿板一下加热到高温，烘出薄板很酥松，使用效果不好。氧化铝G板在150~160oC,烘4小时(Ⅱ级左右)硅胶G板在110oC烘1小时薄板经活化后，一定要储藏在密闭干燥器或烘箱中备用。44/78(2)点样合适点样量，集中斑点是得到一种好色谱必要条件。如何才合适？不一样分离要求、不一样薄板（有厚有薄）、不一样吸附剂（性能不一），需要不一样点样量。从下列图可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果。45/780.12503000.50.30.1Rfg46/78

纯物质判定，若又有高敏捷度显色剂，点样量只需g或ng；若进行天然物或中间产物分离时，点样量需50g~几百微克；若进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可用内径约1mm，管口平整毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次滴加样品。47/78注意点：a.溶解试样溶剂最佳是挥发性b.点样宜分几次点加,即点一次后,用吹风机冷风吹干,再点,再吹干,.......,反复,直到点完所要求量c.点样量体积尽也许小些(2~10L左右)d.点样最佳是在密闭室中或比较干燥环境下完成,避免薄板吸水减少活性.48/7815cm2.5cm1.5cm溶剂前沿49/78（３）展层薄层展开需在密闭器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂薄板只能作近水平式（与平面成20~10oC角）上行或下行展层而不能垂直展层。50/78把点好样品薄板浸入0.5cm深合适展开剂中，当展开剂移动至离起点约10~20cm处(约30min)，将薄板取出放平，用铅笔或小针记下溶剂前沿位置后，在室温干燥或烘箱内干燥，测其Rf值。51/78注意：每次展层距离要固定，方便Rf值反复52/78（４）检出a.本身是有色物，能够直接观测斑点位置和颜色b.本身无色但在紫外线照射下会发出不一样颜色荧光c.薄板本身有荧光（硅胶HF254+366,硅胶GF254,......),欲测物吸取紫外线,在荧光背景下呈暗色53/78d.多数有机物,喷10~50%H2SO4(或铬硫酸)并在100~120oC加热,使有机物碳化,观测加热中有机物颜色变化及碳化斑点位置,能够推断物质化学性质e.喷显色剂或荧光试剂（不含粘合剂薄板不能喷，只能浸，以免把吸附剂吹散）54/78主要显色试剂试剂配制及使用措施检出范围浓H2SO4喷雾,100~120oC,观测颜色变化高级醇、醛、酮、甾体H2SO4-K2Cr2O75gK2Cr2O7+100mLH2SO4,喷雾,280oC观测颜色变化所有有机物2’,7’-二氯荧光黄(0.2%乙醇)喷雾，紫外线照射所有有机物I2-KI1gI2+10gKI溶于50mLH2O中，加入2mLHAc，稀释至100mL，喷雾生物碱55/78试剂配制及使用措施检出范围溴甲酚绿0.04g溶于100mL乙醇中，以0.1mol/LNaOH调至蓝色刚消失，<pH3.6显黄色羧基酸Ag(NH3)2+2.6gAgNO3溶于50mL水，加入NH3H2O至沉淀刚好消失还原性物质、醛、还原糖茚三酮0.5%丙酮溶液胺类（如麻黄碱、氨基酸等）FeCl31g溶于100mL酚羟基、鞣质、黄酮磷钼酸5g溶于100mL95%乙醇脂肪、甾类、类脂、三萜酸、生物碱56/78层析分离分类根据流动相分类气相层析液相层析超临界流体层析根据压力分类低压（不大于0.5Mpa)中压(0.5-5Mpa)高压(5-40Mpa)57/78色层分离基本概念分派系数Kd---分派系数q、c---溶质在固相和液相中浓度体现某一种溶质与固定相之间亲和力大小阻滞原因58/78