发酵工程课件

微生物发酵工程6无菌保障

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6无菌保障26无菌保障第2页；无菌保障设备无死角种子，培养过程加入物料无污染。培养基和生产环境灭菌好氧发酵过程空气除菌；36无菌保障第3页灭菌（除菌）办法培养基湿热灭菌空气过滤除菌发酵污染与防治6无菌保障46无菌保障第4页灭菌：用物理或化学办法杀灭或清除物料或设备中一切生命过程。某些化学药剂能使微生物中蛋白、酶及核酸发生反应。乙醇，甲醛，氯，高锰酸钾，环氧乙烷，季銨盐，臭氧等。主要用于器械和环境灭菌和消毒化学灭菌1160℃下保温1-2h。要求保持干燥器具和材料。干热灭菌34利用饱和蒸汽进行灭菌。有效，使用广泛。2利用电磁波、紫外线、x射线、r-射线等射线灭菌湿热灭菌过滤除菌利用过滤办法截流微生物，达成除菌目标。适用于热敏性培养基和制备无菌空气过滤除菌356无菌保障第5页原理：当温度超出最高程度时，微生物细胞中原生质和酶基本成份----蛋白质发生不可逆变化，使微生物在很短时间内死亡。以能否杀死芽孢细菌为标准。杀死微生物极端温度称为致死温度。在致死温度下，杀死所有微生物所需时间称为致死时间。

6.2培养基湿热灭菌66无菌保障第6页培养基进行湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡速率与残余微生物数量成正比。即：dN/dt=-kN式中：N---培养基中残留活菌数（个）

t---受热时间（min）

k---反应速率常数或比死亡速率（min-1）一．微生物死亡速率与理论灭菌时间76无菌保障第7页若开始灭菌时（t=0），培养基中微生物数量为N0，将上式积分得：

lnN/N0=-ktN=N0e-kt(对数残留定律)lnN/N0=-ktt=1/klnN0/Nt

t=2.303/klgN0/Nt

计算时，Nt

一般可取0.001，N0

可参照一般培养基中活微生物数，取（1-2）X107而得。86无菌保障第8页灭菌时间污染程度灭菌程度k值一般110-130℃，5-20min培养液采取高温短时间加热方式，能够达成彻底灭菌并且减少对培养液成份破坏。96无菌保障第9页k微生物种类加热温度K值越大，微生物越容易死亡106无菌保障第10页

即:

k=Ae-△E/RT式中：A---频率因子△E---杀死微生物所需活化能

R---气体常数，8.314J/（mol·K）

Lgk=-1△E/2.303RT+lgA耐热芽胞杆菌A取作1.34X1036s-1△E取2.844X105J/molk值伴随温度变化遵循阿仑尼乌斯定律116无菌保障第11页以Lgk与1/T作图，得始终线，从直线斜率和截距求得△E和A。进而根据灭菌温度能够求出k值，并计算出灭菌时间。一般杀灭微生物营养细胞△E值约为2.09X105-2.71X105J/mol,

杀死微生物芽孢△E值约为4.48X105J/mol。126无菌保障第12页

由于加热灭菌过程中对培养基破坏反应速率常数也符合阿仑尼乌斯定律，同理计算出了培养基中某营养成份分解△E，值。一般酶和维生素等营养成份分解△E，值为8.36X103-8.36X104。136无菌保障第13页

由于灭菌时杀死微生物活化能△E值大于培养基营养成份破坏活化能△E，值，因此伴随温度升高，灭菌速率常数增加倍数大于培养基中营养成份分解速率常数增加倍数。

lnk2/k1△Elnk’2/k’1△E，

因此较高灭菌温度，较短灭菌时间能减少培养基营养成份损耗。146无菌保障第14页1．分批灭菌，不计升温阶段所杀灭菌数，

t=2.303/klgN0/Nt

例1．有一发酵罐内装40m3

培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2X105

个耐热细菌芽孢，121℃

时灭菌速率常数为1.8min-1

求灭菌失败几率为0.001时所需要灭菌时间

解：N0=40X106X2X105=8X1012个

Nt=0.001个

K=1.8min-1

灭菌时间：t=2.303/1.8lg（8X1012/0.001）=20.34min二．培养基灭菌时间计算156无菌保障第15页例2.若将例1中培养基采取连续灭菌，灭菌温度131℃，此温度下灭菌速率为15min-1。求灭菌所需维持时间。解：C0=2X105(个/ml)Cs=1/40X106X1000=2.5X10-11(个/ml)

灭菌所需时间

t=2.303/15lg（2X105/2.5X10-11）

=2.37min166无菌保障第16页1．分批灭菌：将配制好培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备仪器灭菌操作过程，也称实罐灭菌。

分批灭菌长处缺陷设备投资少，灭菌效果可靠，对蒸汽要求低（0.2-0.3MPa）。培养基破坏作用大，操作难于自动化。三．培养基灭菌：176无菌保障第17页186无菌保障第18页196无菌保障第19页206无菌保障第20页

将配制好培养基在高温迅速情况下，向发酵罐输送同步通过加温，保温，冷却过程进行灭菌。2.连续灭菌216无菌保障第21页226无菌保障第22页236无菌保障第23页246无菌保障第24页256无菌保障第25页

6.3空气过滤除菌

一、发酵用无菌空气质量标准:发酵用无菌空气,就是将自然界空气通过压缩,冷却,减湿,过滤等过程达成:266无菌保障第26页

1连续提供一定流量压缩空气。2空气压强为0.2-0.4Mpa3进入过滤器之前，空气相对湿度≤70%4进入发酵罐空气温度可比培养温度高10-30℃5压缩空气洁净度一般以失败概率为10-3为指标。276无菌保障第27页二.空气除菌设备

286无菌保障第28页三.空气净化流程1.空气预处理1).

采风塔:≥10m,上风头,流速8m/s.

2).

粗过滤器:前置过滤器,拦截空气中较大灰尘以保护空气压缩机,同步减轻总过滤器负担.过滤介质采取泡沫塑料或无纺布.实际流速为0.1-5m/s.3).

空气压缩机:提供动力以克服随后各设备阻力.4).

空气贮罐:主要为消除压缩机空气脉动,尤其是对于往复式空压机.296无菌保障第29页5).冷却器:温度120℃左右,必须冷却。降湿。6).气液分离设备:除去空气中水和油保护过滤介质.有利用离心力沉降旋风分离器,和利用惯性拦截介质分离器.旋风分离器：利用离心力进行气液和气固沉降分离设备。构造简单，阻力小，分离效率高。可清除空气中绝大多数20μm以上液滴。不过10μm左右液滴，除去效率只有60-70%

。丝网除沫器：可除去1μm以上雾滴，清除率为98%。7）.空气加热设备此时压缩空气湿度为100%306无菌保障第30页316无菌保障第31页326无菌保障第32页

2．空气过滤除菌过滤介质绝对过滤深度过滤介质空隙不大于被拦截微生物大小，如用聚四氟乙烯或纤维素酯材料做成微孔滤膜。介质孔隙大于被拦截微生物大小，但介质有一定厚度，机理是静电，扩散，惯性及拦截作用。如棉花过滤器，超细玻璃纤维纸，金属烧结管等。336无菌保障第33页1).纤维及颗粒状介质过滤器：用于总过滤器。346无菌保障第34页棉花：未脱脂棉花，纤维直径为16-20μm，其实密度为1520Kg/m3。填充率为8.5-10%。

玻璃纤维：用无碱玻璃纤维介质作为过滤介质。纤维直径为3-20μm，其实密度为2600Kg/m3。填充率为5-11%。

活性炭：常与纤维状介质分层堆放成过滤床。通过过滤器气流速度一般为0.2-0.3m/s,对应压力降也较小。356无菌保障第35页366无菌保障第36页过滤器进行灭菌时，一般是自上而下通入0.2-0.4Mpa蒸汽，灭菌45min后用压缩空气吹干备用。总过滤器约每个月灭菌一次。376无菌保障第37页介质:超细玻璃纤维纸。孔径:1-1.5μm厚度:0.25-0.4mm实密度:2600Kg/m3填充率:14.8%。除菌效率高，阻力小，强度低。用酚醛树脂，甲基丙烯酸树脂等处理以提升防湿能力用多孔板夹住提升其抗冲击能力。2).滤纸过滤器：386无菌保障第38页396无菌保障第39页3）金属烧结管空气过滤器：压缩空气进入壳程，通过金属微孔滤管壁除去杂菌和颗粒，得到无菌空气由管程排出。使用寿命长，耐高热，气体阻力小，安装维修方便。空气预过滤器和蒸汽过滤器。406无菌保障第40页4）微孔膜过滤器----绝对过滤器：

由耐高温，疏水，厚度为150μm聚四氟乙烯薄膜组成。能绝对滤除所有大于0.01μm以上微粒，能除去几乎所有空气中夹带微生物。

过滤器体积小，处理量大，压降小，除菌效率高416无菌保障第41页426无菌保障第42页3．空气净化流程：粗过滤器一级冷却器空气加热器分过滤器无菌空气二级冷却器分水器空气贮罐旋风分离器空气压缩机丝网除末器空气吸气口总过滤器436无菌保障第43页1）.两级冷却，加热除菌流程特点：两次冷却，两次分离，合适加热。适应性广，充足分离油水，节省冷却水。446无菌保障第44页2）.冷热空气直接混合式空气除菌流程特点：省去第二冷却后分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量少。适用于中等湿度地域。456无菌保障第45页3）.高效前置过滤