抗体制药的基本原理

第四章抗体制药2023/10/101第1页掌握：单克隆抗体制备原理、办法及基本过程；单克隆抗体药品靶标选择；基因工程抗体类型。熟悉：噬菌体抗体库技术原理和基本过程；单链抗体、双特异抗体制备办法；转基因动物体现抗体办法。理解：抗体药品发展趋势。学习要求:第2页第一节概述第二节单克隆抗体及其制备第三节基因工程抗体及其制备第四节噬菌体抗体库技术第五节转基因动物体现抗体第六节抗体治疗药品2023/10/103内容第3页第一节概述一、基本概念抗体（antibody，Ab）：指能与对应抗原特异性结合具有免疫功能球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）:具有抗体活性或化学构造与抗体相同球蛋白IgAb化学构造上概念生物学功能上概念2023/10/104抗体工程制药：利用基因工程、细胞工程和转基因动植物技术生产抗体药品过程。第4页2023/10/105第5页免疫球蛋白（抗体）基本构造1、重链和轻链重链可分为α、δ、ε、γ、μ链；轻链可分为κ、λ型。抗体类型由重链类型决定，上述重链分别对应了IgAIgDIgEIgGIgM2、可变区和恒定区

重链和轻链N端第一种构造域为可变区（variableregion,V区)，轻链其他1个及重链3-4个构造域为恒定区；

V区存在3个高变区也称互补决定区(complementarity-determiningregion,CDR1~3)及4个骨架区（frameworkregion,FR1~4).三个高变区共同组成Ig抗原识别部位，形成与抗原决定基互补表位。

第6页2023/10/107第7页2023/10/108多克隆抗体：病原微生物具有多种抗原决定簇抗原物质，对其产生抗体也是多种抗体混合物，称为多克隆抗体。单克隆抗体：针对一种抗原决定簇抗体，又是单一B淋巴细胞克隆产生、高度特异、均一、起源稳定、可大量生产抗体。多抗与单抗第8页传统抗血清抗原免疫所有抗体混合123412341234脾脏淋巴結B細胞多克隆抗体制备过程第9页1234mmmm12341234单抗细胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗体分开单克隆抗体制备过程第10页疾病诊断和治疗：诊断:检测与某些疾病有关抗原，辅助临床诊断。临床治疗：如针对T淋巴细胞共有分化抗原CD3单克隆抗体，对器官移植排斥反应有显著抑制作用，用作免疫抑制剂。作为载体制备导向药品（Antibodydrugconjugates,ADC）治疗肿瘤。2023/10/1011抗体应用第11页需处理问题：鼠源性单克隆抗体免疫原性（HAMA）；完整抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效治疗浓度；延长半衰期。其他2023/10/1012第12页基本消除了单克隆抗体鼠源性（免疫原性）,鼠源氨基酸只占完整抗体分子1/80~1/3，只保存同抗原特异性结合活性。制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型抗体或抗体单位。2023/10/1013基因工程技术为处理问题提供了也许第13页二、抗体工程发展历程及趋势1890年，Behring和北里柴三郎发觉白喉抗毒素1937年，Tiselius等人用电泳法将血清蛋白分为白蛋白、甲种（α）球蛋白、乙种（β）球蛋白、丙种（γ）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年，KöhlerandMilstein等初次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1976年，SusumuTouegava（利根川进）揭示了抗体多样性遗传学基础。1984年报道了人—鼠嵌合抗体多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体2023/10/1014第14页2023/10/1015整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术

噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核体现技术第15页商业化抗体药品2023/10/1016第16页2023/10/10FDA同意抗体药品全抗体37个（至2023.10月）抗体片段3个ADC3个（1个已撤市）双特异抗体2个Fc融合蛋白7个鼠源嵌合人源化人源ADC1986OKT31994ReoPro1997RituxanZenapax1998SimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrel2023Mylotarg2023Campath2023ZevalinHumira2023XolairBexxar2023AvastinErbitux2023LucentisVectibix2023Soliris2023Cimzia2023StelaraSinponi2023ActemraNumax2023BenlystaYervoyAdcetris2023PerjetaEylea2023KadcylaGazyva2023CyramzaSylvantEntyvioKeytruda第17页2023年全球生物药品销售额前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai12.54RATNF2RemicadeJ&J9.24RA、Crohn’sTNF3RituxanBiogen-IDEC8.678Non-Hopkin’sLymphomaCD204EnbrelAmgen8.538RA、牛皮癣TNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.279I/II型糖尿病/6AvastinRoche/Genentech6.957结肠癌，NSCLCVEGF7HerceptinRoche/Genentech6.793乳腺癌，胃癌HER28NeulastaAmgen4.39白细胞减少症/9LucentisRoche/Genentech,Novartis4.27AMDVEGF10EpogenAmgen3.35贫血及癌症化疗引发贫血/第18页2023年14个抗体药品销售过10亿美元2023/10/1019110.265.687.7683.867567.51第19页生物药品专利悬崖Pharmaceuticals2023,5,1393-1408生物技术药品研发热浪涌向中国第20页重磅化药销售Pharmaceuticals2023,5,1393-1408第21页第二节单克隆抗体及其制备2023/10/1022一、抗体分子构造与功能二、单克隆抗体制备第22页

(1)Fab段2个抗原结合片段

fragmentwithantigenbinding

(2)Fc段1个可结晶片段

fragmentcrystallized

Porter木瓜蛋白酶

(1)F(ab’)2段1个

结合颗粒性抗原出现凝集反应

(2)Fc’段1个

无生物学活性Nisonoff胃蛋白酶1、酶解片段一、抗体分子构造与功能第23页

（1）、轻链（lightchain，L链）

214个氨基酸残基，24KD。分为：κ与λ

2个亚型。（2）、重链（heavychain，H链）

450-550个氨基酸残基，55-75KD。分为5类，μ、γ、α、δ、ε链。

IgM，IgG，IgA，IgD，IgE。

2、重链和轻链第24页3、可变区和恒定区（1）可变区（Variableregion，V区）

L链N端1/2处（VL）110个aa;

H链N端1/5-1/4处（VH）118个aa。HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3

骨架区（frameworkregion,FR）高变区（hypervariableregion,HVR）

互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR），

（2）恒定区（constantregion，C区）

L链C端1/2处，105个aa;H链C端3/4-4/5处，331-431个aa。

在同一种属动物中是比较恒定,是制备第二抗体进行标识主要基础。第25页4、功能区链内二硫键折叠成球形区称为功能区，约由110个aa组成。（1）L链：2个，VL，CL各1（2）H链：

IgG，IgA，IgD：4个（V区1个，C区3个）

IgM，IgE：5个（V区1个，C区4个）

（3）功能区作用：（a）VL和VH：结合抗原决定簇（FV区）（b）CL和CH：具有同种异型遗传标识（c）CH2：结合补体（d）CH3：结合Fc受体

单核细胞，巨噬细胞，粒细胞，B细胞，

NK细胞

第26页5、抗体基因构造2023/10/1027人类编码Ig基因分别位于不一样染色体重链（Heavychain)基因：位于14号染色体；轻链基因：κ链基因位于2号染色体；λ链基因位于22号染色体。每条肽链编码基因可分为V区和C区两大部分。V区基因是由不一样基因片段拼接而成重链V区：由V、D、J片段拼接；轻链V区：由V、J拼接。C区拼接决定了抗体类别（

μ、γ、α、δ、ε）第27页胚系重链基因构造：(a)鼠(b)人第28页重链VDJ重组2023/10/1029第29页轻链基因胚系及重排后构造第30页抗体类别转换2023/10/1031第31页V区功能：识别并特异性结合抗原C区功能：激活补体系统：抗体与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体典型途径及补体旁路途径；介导免疫细胞活性：抗体调理作用；ADCC作用；介导超敏反应。穿过胎盘和黏膜：IgG是唯一能从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内抗体；IgA合成主要作用部位在黏膜，是黏膜局部抗感染主要物质。2023/10/10325、抗体功能第32页2023/10/1033第33页抗体功能（C区）-ADCC2023/10/1034第34页抗体功能（C区）-CDC2023/10/1035IgG4、IgA、IgE第35页二、单克隆抗体及其制备2023/10/1036抗原与动物免疫细胞融合与杂交瘤细胞选择性培养筛选阳性克隆与克隆化杂交瘤细胞与抗体性状判定单克隆抗体大量制备单克隆抗体纯化第36页单克隆抗体制备原理37第37页单克隆抗体制备基本技术1、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原；制备特定抗原单克隆抗体，要制备用于免疫合适抗原，再用抗原进行动物免疫。能够用化学合成：地高辛多数抗原物为混合物用整个肿瘤细胞做为免疫原，通过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上表面标志分子单克隆抗体。免疫动物：BALB/c小鼠或Lou大鼠；目前常用骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和LOU大鼠。免疫办法：体内免疫和体外免疫(体外致敏淋巴细胞)。

第38页体内免疫法：

适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄雌性鼠。

颗粒性抗原（细胞抗原）免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，追加免疫1～2次。可溶性抗原：按10～100μg抗原/小鼠与福氏完全佐剂和灭活分枝杆菌等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2～4周，再用不加佐剂原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原。刺激B细胞分裂。第39页二、细胞融合与杂交瘤细胞选择培养

基本办法：脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107~3*107）混合，在PEG作用下诱导融合(2min)，用培养液将PEG融合液迟缓稀释。骨髓瘤细胞：SP2/0、P3.653，为缺陷性。PEG:分子量4000PEG是最常用细胞融合剂；常用浓度为40%~50%，相对分子质量4000为佳。为了提升融合率，在PEG溶液中加入DMSO，以提升细胞接触紧密性，增加融合率。但必须严格限制接触时间。作用机理：诱导细胞膜上脂类物质构造重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合第40页细胞融合步骤：将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1～10：1百分比混匀于50ml锥形离心管内200rpm离心7—10分钟，尽可能吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀细胞铺展成薄层在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%PEG0.5ml，随后静置60秒再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清培液或盐水缓冲液，以终止PEG作用再静置10分钟。第41页可生产有用抗体

淋巴細胞

若与

癌细胞融合，则形成稳定而可培养细胞株。癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组染色体混在一起也能够培养生長产生专一性抗体一個Bcell只产生一种抗体第42页细胞融合液中如何清除脾-瘤以外融和细胞？

处理办法：选择性培养基(HAT）

第43页HAT培养基筛选杂交瘤细胞HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）一种选择性培养基，其中三种成份与细胞DNA合成有关。第44页m核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黄嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶胸腺嘧啶核苷激酶叶酸拮抗物第45页2023/10/1046第46页选择性培养办法：将融合细胞悬浮于HAT培养液，加入到96孔板内每2~3天换液一次。换液时吸去1/2~2/3培养液，加入等量新鲜培养液。7天内:用HAT培养液，杀死瘤-瘤融合细胞后，第7~14天:改用HT培养液，14天后来:用一般RPMI1640完全培养液。从融合后8~9天就可对所有克隆生长孔培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体阳性克隆。第47页大量细胞在HAT培养基中死亡，单个或少数杂交瘤细胞不易存活？处理措施：饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞最适条件下,105个脾细胞形成1个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数杂交瘤细胞多半不能存活，加入饲养细胞才能使其繁殖。第48页原因:饲养细胞能释放某些生长刺激因子能满足杂交瘤细胞对细胞密度依赖性小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用较多。第49页三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：产生特定抗原抗体产生细胞:占所有脾细胞5%微量、迅速、特异、敏感、简便，并一次能检测大批标本办法。检测办法：免疫酶技术；免疫荧光技术；放射免疫技术；FACS2023/10/1050第50页ELISA第51页1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10

g/ml，4℃，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4℃，1h）3、加辣根过氧化物酶标识羊抗鼠抗体（）（4℃，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体筛选2023/10/1052第52页（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法应尽早克隆化:含不分泌细胞,多株分泌细胞,染色体易丢失克隆化：单个细胞通过无性繁殖而取得细胞集团整个培养过程。其中每个细胞生物学特性和功能完全相同。一般3次克隆化，才能达成100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用克隆化办法有：有限稀释法、软琼脂法、流式细胞法。2023/10/1053第53页有限稀释法：通过合适稀释达成分离单个细胞进行培养目标：杂交瘤细胞悬液稀释，加入到96孔细胞培养板，使每个孔中在理论上只具有一种细胞。例：取出阳性孔内细胞进行计数；用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞；假如在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一种细胞；加入一定数量饲养细胞，通过8~12天后，可观测到有集落生长孔；据检测阳性成果再次进行克隆化。2023/10/1054第54页软琼脂法：培养液中加入0.5%左右琼脂糖凝胶细胞分裂后形成小球样团块，用毛细吸管将小球吸出团块打坏后移入96孔板继续培养可吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，因此该法容易成功。2023/10/1055第55页

四、杂交瘤细胞与抗体性状判定（一）杂交瘤细胞判定：鼠脾细胞染色体数:40，端着丝粒;小鼠骨髓瘤细胞染色体:SP2/0细胞为62~68，NS-1为54~64，中部和亚中部着丝点;杂交瘤细胞染色体数目:亲本细胞数目总和，多数为端着丝粒，少数标志染色体;染色体数目多且较集中杂交瘤细胞分泌高效价抗体；

第56页Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法特异性测定：抗原类似物交叉反应效价测定：用腹水或培养液稀释度表达

表位测定：竞争抑制法亲和性测定：测定亲和常数K杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法McAb靶抗原分子量：常用westernblot（二）抗体性状判定第57页五、单克隆抗体制备（1）体外培养法：可取得10g/ml抗体；多采取RPMI1640培养液，添加10%~20%胎牛或小牛血清。（2）动物体内诱生法：可取得5~20mg/ml抗体。目前多采取2023/10/1058第58页体内诱生法：由于杂交瘤细胞两种亲本细胞均来自BALB/c小鼠，因此应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。可于注入细胞几周前，预先将具有刺激性有机溶剂降植烷（pristane）注入腹腔内，以破坏腹腔内膜，建立杂交瘤易于增殖环境。长处：操作简便，经济，所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌杂交瘤细胞株2023/10/1059第59页小结第60页第61页六、单克隆抗体纯化动物体内诱生法制备单克隆抗体详细纯化办法及过程1、澄清和沉淀处理离心1000g×5min：清除残留小颗粒物质（小鼠腹水中具有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等）；0.2m微孔滤膜过滤：除掉污染细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体：50%饱和硫酸铵能回收90%以上单克隆抗体。2023/10/1062第62页1.名词解释：抗体；免疫球蛋白；多克隆抗体；单克隆抗体2.单克隆抗体有哪些不足？如何改造？3.大量制备单克隆抗体办法主要有哪些？4.制备单克隆抗体一般流程是什么？（如何制备杂交瘤细胞？）思考题2023/10/1063第63页第三节基因工程抗体基因工程抗体(Geneticengineeringantibody)

根据研究者意图，采取基因工程办法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行体现，产生新型抗体。目标：保存天然抗体特异性和主要生物活性，清除或减少无关构造及鼠源单抗不足；赋予抗体分子新生物活性。原理：抗体同抗原结合功能决定于抗体分子可变区（V），同种性免疫源性则决定于抗体分子稳定区（C）。第64页内容1、人-鼠嵌合抗体（ChimericAntibody）2、人源化改型抗体（HumanizedAntibody）3、单链抗体4、单域抗体与分子识别单位5、双功能抗体6、抗体融合蛋白2023/10/1065第65页基因工程抗体类型人-鼠嵌合抗体改型抗体（人源化抗体）FabFv单链抗体单域抗体最小识别单位抗体融合蛋白2023/10/1066单域抗体最小识别单位单链抗体小分子抗体第66页1人一鼠嵌合抗体(ChimericAntibodies)

人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗可变区与人抗体恒定区融合而得到抗体。第67页Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略构建嵌合抗体过程：鼠源单抗可变区基因连到包括有人抗体恒定区基因并构建到表达所需其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。第68页鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体第69页2人源化改型抗体(Reshapingantibody)鼠单克隆抗体V区人源化

尽管嵌合抗体免疫原性已减少很多，但有时它仍也许引发较强免疫反应。为了深入减少抗体鼠源成份，发展出CDR移植技术。

CDR移植:即把鼠抗体CDR序列移植到人抗体可变区内，所得到抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体（humanizedantibody)。第70页

通过CDR移植，抗体免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变

结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)改形抗体都已有报道，到目前已有数百种人源化抗体。（美国正式上市28种治疗性单抗中多数是人源化抗体）第71页

人源化抗体构建可用全合成法或定点突变法。全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体CDR置换人抗体CDR，将整个可变区序列两条链分解成若干片段，并使相邻片段具有彼此互补粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整可变区基因，插入质粒中，深入即可用于构建和体现改形抗体。第72页

定点突变法是将人可变区基因克隆，根据鼠抗体CDR序列合成几个突变引物，用定点突变办法将人可变区基因CDR序列变为鼠抗体CDR序列，然后体现出改型抗体。研究表白，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替代并不能确保抗体具有好亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点空间构造框架序列（FR）进行操作。第73页单链抗体(singlechainFv,scFv)P154:由一段弹性连接肽（linker）把可变区重链（VH）与轻链（VL）相连而成，具有亲代抗体所有抗原结合特异性最小功能构造单位。连接肽长度在10-15个氨基酸左右，具有一定弹性和蛋白酶抗性，常用连接肽是(GGGGS)3它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。

3单链抗体（ScFv）Fv由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定,在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到单链抗体。第74页分子小，保持完整抗原结合位点，易进入组织；易于进行分子改造，融合毒素、酶、药品等组成双功能抗体。免疫原性低；可在大肠杆菌中体现；缺乏Fc段，不与非靶细胞（Fc受体阳性细胞）结合，易进入组织，偶联成像可用于诊断；体内半衰期短易从血循环中清除；亲和力和稳定性较完成抗体低；因只能与抗原结合，不能激活补体激活细胞免疫（CDC）及抗体依赖细胞毒效应（ADCC）。2023/10/1075单链抗体（ScFv）特点第75页

单链抗体构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;

从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR办法扩增可变区基因VH,VL，将二者连接成ScFv基因，再组装到合适体现载体上。ScFv基因构建第76页

单链抗体最常用体现体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是体现为包涵或非包涵体不溶蛋白。但需进行变性复性，使其形成正确立体构造，恢复抗体活性;

二是分泌型体现，将细菌信号肽序列与单链抗体氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性分子。重组ScFv体现第77页双价及多价ScFv2023/10/1078连接肽（linker）较短时，同一ScFv分子内VH与VL不能互相配对，分子间VH，VL功能区配对成一种二价二聚体，也可组成三聚体或多聚体。第78页

抗体VH、VL约为完整分子1/12,只由一种构造域组成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所减少，但仍保持着原单抗特异性。

4、单域抗体和分子识别单位VH分子识别单位：约为完整分子1/80-1/70大小，一般由一种CDR组成，它也保持着抗体特异性。第79页即双特异性抗体(bispecificantibody,BSAb)是指能同步识别2种抗原抗体。5、双（多）功能抗体第80页

Hollinger等将Ａ抗原抗体轻链可变区基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子体现质粒中,构建成双链抗体体现质粒,目前报道体现质粒均为双顺反子。体现后,VLAVHB与VHAVLB交叉连结,形成双特异性抗体。第81页双功能抗体实例

能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,并且能够模拟天然配体作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞杀伤和裂解。与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗新突破。第82页Catumaxomab2023/10/1083第83页多功能抗体

第84页6、抗体融合蛋白将抗体片段（V区或C区）连接到与抗体无关其他蛋白上，发明出抗体有关分子，称为抗体融合蛋白（antibodyfusionprotein）。分类：Fv抗体融合蛋白：抗体Fv与其他生物活性蛋白结合，主要用于导向治疗领域。Fc抗体融合蛋白：抗体Fc段与某些有黏附或结合功能蛋白质融合而取得融合蛋白。2023/10/1085第85页Fv-抗体融合蛋白抗体与毒素、酶、细胞因子等生物活性分子融合达到特异杀伤肿瘤细胞目。抗体与毒素偶联：绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素（II期）；抗体与酶蛋白融合：也称为抗体酶（abenzyme），前体药物疗法（ADEPT）；抗体与细胞因子融合：IL-2，免疫介导疗法；2023/10/1086第86页Fc-抗体融合蛋白具有与特定蛋白（ProteinA,ProteinG）结合特点，便于检测与纯化；Fc介导抗体效应功能，如：ADCC、CDC及免疫调理作用；延长蛋白在血液中半衰期；实例：CD4-Fc;CTLA4-Fc;TNFaR-Fc;VEGFR-Fc(VEGF-TRAP)2023/10/1087第87页2023/10/1088第88页思考题一、名词解释1、可变区2、恒定区3、互补决定区4、功能区5、人—鼠嵌合抗体6、改形抗体7、Fab抗体8、Fv抗体9、单链抗体（scFv）10、单域抗体11、双特异单链抗体（bisFvs）二、简答1、简述抗体构造与功能、抗体多样性遗传学基础。2、基因工程抗体有哪些类型？其特性有何不一样？3、抗体融合蛋白有哪些类型，特性和设计策略是什么？试举例说明。4、多价抗体特点？2023/10/1089第89页

第四节噬菌体抗体库技术抗体研究三个阶段：①以1890年Behring发觉白喉抗毒素为代表，其特点是用抗原免疫动物来取得多克隆抗体；②以1975年Köhler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表；③以1994年Winter以基因工程办法制备抗体为代表。抗体研究领域一次技术革命，完全用基因工程技术制备人源化抗体，还能利用基因转移和体现技术，通过细菌发酵或转基因动物或转基因植物大规模生产抗体。在此基础上发展成抗体工程。Winter创建了噬菌体抗体库（Repertoireofantibodiesdisplayedonphages）技术,克服了人体不能随意免疫缺陷，用人外周血制备抗体文库，从而取得人源性基因工程抗体。第90页将蛋白分子或多肽基因克隆到丝状噬菌体基因组DNA中，使噬菌体表面体现该异源分子，称为噬菌体展示。将B细胞全套可变区基因克隆，插入丝状噬菌体体现载体转化工程菌进行体现，在噬菌体表面形成噬菌体抗体群体，即为噬菌体抗体库（surfacedisplayantibodylibrary）。噬菌体展示抗体库技术第91页用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因（获取目标基因）克隆到噬菌体载体并以融合蛋白形式体现在其外壳表面（载体构建）用抗原抗体反应筛选出体现所需要抗体克隆并扩增。（淘筛和判定）使抗体基因以分泌方式体现，筛选可溶性抗体片段。抗体库：组合抗体文库：在建库过程中假如将VH和VL随机组合人天然抗体库：抗体mRNA起源于未经免疫正常人一、基本原理和程序第92页噬菌体抗体库第93页丝状噬菌体基因基因编码产物功能gIpI噬菌体装配gIIpII噬菌体基因组复制gIIpIII尾端外壳蛋白，与F因子结合gIVpIV噬菌体装配gVpV噬菌体基因组复制gVIpVI外壳蛋白，末端“塞子”gVIIpViI外壳蛋白，高度疏水，组装起始信号gVIIIpVIII主要外壳蛋白gIXpIX外壳蛋白，高度疏水，末端“塞子”gXpXgIII启动子激活蛋白第94页第95页第96页噬菌体表面展示文库技术重点外源基因体现多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白基因g3或g8先导系列紧靠下游随机克隆入对应载体形成组合文库从免疫或未被免疫B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段第97页用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出体现特异性好、亲和力强抗体噬菌体库。使翻译出抗体分泌到细菌质周腔内，形成游离抗体片段，通过纯化即可取得目标抗体。筛选到噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，第98页1、获取目标基因：提取RNA，经RT-PCR获取抗体某一特定基因区段。

2、抗体库技术载体：普遍使用噬菌粒（phagemid）载体。

3、淘筛（panning）：用固相化抗原对体现产物载体进行淘筛，淘汰非目标克隆，使目标克隆大量扩增。

4、体现与判定：目标克隆通过判定后，再导入感受态菌珠，进行可溶性体现，其产物用Westernblot分析确定后，就完成了全过程。噬菌体抗体库技术基本办法小结第99页二、噬菌体抗体库技术特点1、模拟天然全套抗体库抗体文库能够达成或超出1011库容，因此能包括B细胞所有克隆。建库外源基因来自人体外周血、骨髓或脾脏淋巴细胞提取mRNA反转录形成cDNA扩增，这是人体多克隆细胞总mRNA。使用通用引物采自多种人体，具有人种属普遍性。抗体VH和VL基因随机重组也增加了抗体多样性。第100页2、避开了人工免疫和杂交瘤技术由于抗体库大容量和极高筛选效率，使得能够调出任意抗体基因，用基因工程办法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。3、可取得高亲和力人源抗体在噬菌体抗体库技术中，VH和VL基因随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又来自人体，因此，所产生抗体必然都是高亲和力人源化抗体。第101页将抗体基因型和表型紧密联系起来;可绕过杂交瘤技术，不需要复杂基因工程技术;抗体基因筛选范围广;技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产;适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其他蛋白如激素、酶、药品、随机多肽等生产。该项技术长处:第102页

噬菌体抗体库技术发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，并且在表型一基因型统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。使ScFv以融合蛋白形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术成功给抗体基因筛选工作带来了革命性变革。第103页

第六节抗体治疗药品

自第一种抗体药品同意上市以来，已被成功用于治疗肿瘤、本身免疫疾病等多种“疑难杂症”，截止2023年6月，美国FDA同意28种抗体药品，抗肿瘤占53.8%，免疫性疾病：19.2%、器官移植11.5%、感染性疾病7.7%、心血管疾病3.8%、其他3.8%。第104页商业化抗体药品2023/10/101055个靶标抗体仿制药开发是热点:CD20，HER2，EGFR,VEGF,TNF-alpha第105页2023/10/10106VEGFTargetAnti-VEGFStrategy第106页HER2signalingpathwayandAnti-HER2Strategy第107页108CombinationstrategiestopotentiatecellularresponseandovercomeresistanceNancyE.Hynes

andHeidiA.Lane.ERBBreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitors.NatRevCancer.2023;5:341-354.第108页2023年全球生物药品销售额前10名NO.DrugCompanySale(billion$)IndicationTarget1Humira(adalimumab)AbbVie&Eisai11.00RATNF2EnbrelAmgen8.76RA、牛皮癣TNF3RemicadeJ&J8.37RA、Crohn’sTNF4Lantus(insulinglargine)Sanofi7.95I/II型糖尿病/5RituxanBiogen-IDEC7.91Non-Hopkin’sLymphomaCD206AvastinRoche/Genentech6.97结肠癌，NSCLCVEGF7Hercep