大花葱愈伤组织诱导分化及再生体系的建立

大花葱愈伤组织诱导分化及再生体系的建立

大花洋葱也被称为江西花。它是百合科的多年生球根花。它的根和茎是严肃的，带有洋葱的味道。大花葱原产亚洲中部，在世界各国园林绿化中多有种植，主要用于花境、岩石园或草坪旁的装饰和美化，是同属植物中观赏价值较高的一种。目前，我国大花葱的某些新优品种的种球主要依赖进口，但由于价格较贵，不宜大批量引进。大花葱的常规繁殖依靠种子繁殖和分株繁殖，其中，种子繁殖从播种到开花所经历的时间较长，而分株繁殖形成的子球大小不一，且繁殖速度较慢，难以满足市场需求。因此，利用植物组织培养技术培育大花葱种苗、种球是解决大花葱繁殖问题的可靠途径。但目前，有关大花葱组织培养方面的研究国内未见报道，鉴于此，笔者对大花葱愈伤组织诱导、分化及不定芽增殖的相关技术要点进行了研究，以期为今后建立大花葱组培种球繁殖技术体系进行技术积累。1材料和方法1.1试验材料试验材料为大花葱鳞球茎，由上海上房园林植物研究所有限公司提供，品种为“舒伯特”。取材时间为2020年1月。1.2测试方法1.2.1表皮的预处理选择天气晴好的中午，将种植在田间的大花葱鳞球茎完整挖出，去除泥土后带回实验室。先将鳞球茎顶部的叶片及基部的根系剔除干净，再将外表皮剥去，在加入洗洁精的清水中浸洗5min，然后在流水下冲洗45min。在超净工作台上先用75%酒精震荡消毒30s，再分别用0.05%、0.1%的升汞，分别消毒10、15、20min，在消毒剂中加入2～3滴吐温-20，消毒结束后用无菌水清洗5次，时间为5min，最后用无菌纱布吸干表面水分待接种。30d后统计外植体成活率，外植体成活率（%）=（成活数量÷接种数量）×100。1.2.2培养基配方组ms将消毒后的大花葱鳞球茎切成0.5cm×0.5cm的小块，接种在不同激素浓度及配比的MS培养基上，依据培养基配方不同共设5个处理，分别为：（1)6-BA0.25mg/L+2,4-D1.0mg/L;(2)6-BA0.25mg/L+2,4-D2.0mg/L;(3)6-BA0.5mg/L+2,4-D1.0mg/L;(4)6-BA0.5mg/L+2,4-D2.0mg/L;(5)6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L。各培养基配方均添加白砂糖30g/L、琼脂5g/L,pH均为6.0。处理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先暗培养3d再转入光照培养，10d后均转入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培养基中；处理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA为激素组合的培养基中诱导。光照培养条件为温度（25±1）℃、光照时间12h/d、光照强度3000Lux。30d后统计愈伤诱导率，愈伤诱导率（%）=（出愈伤块茎数量÷接种块茎数量)×100。1.2.3ba/naa添加量将初代培养中诱导产生的质地致密的愈伤组织块均割，然后转接到不同激素配比的MS培养基上，依据培养基配方不同共设4个处理，分别为：（1)6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L。各培养基配方均添加白砂糖30g/L、琼脂5g/L,pH均为6.0。光照培养条件同1.2.2。30d后统计不定芽诱导率，不定芽诱导率（%）=（出芽愈伤数量÷愈伤接种数量）×100。1.2.4培养基配方将诱导产生的不定芽及致密愈伤组织接种在不同激素配比的MS培养基上，依据培养基配方不同共设5个处理，分别为：（1)6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L;(2)6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L;(3)6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L;(4)6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L;(5)6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L。各培养基配方均添加白砂糖30g/L、琼脂5g/L,pH均为6.0，光照培养条件同1.2.2。30d后统计芽增殖倍数，芽增殖倍数=继代切割后接种数量÷继代前芽丛数量。2结果与分析2.1升汞和消毒时间对外植体的消毒效果由于大花葱鳞球茎是直接从田间土壤中取得的，而土壤中存在各种微生物，且外植体消毒较为困难，故本试验中采用渗透性强、消毒效果好的升汞溶液进行消毒。由表1可知，采用浓度为0.1%升汞消毒20min的外植体无菌率最高，达70.0%，但由于消毒时间过长，部分外植体死亡，外植体成活率降低。经综合考虑，以浓度为0.1%的升汞消毒15min的消毒效果为最佳，外植体成活率达62.5%。2.2步法处理由表2可知，处理（1）、（2）、（3）、（4）采用二步法，即先在含2,4-D的诱导培养基中培养10d，然后转入不含2,4-D的培养基中，诱导率均达70%以上，而处理（5）采用一步法，即直接在以6-BA和NAA为激素组合的培养基中培养，其诱导效果较差，诱导率仅为26.7%。经综合考虑，大花葱愈伤组织诱导宜采用二步法，即先在以6-BA0.5mg/L和2,4-D2.0mg/L为激素组合的培养基中培养10d，再转入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培养基中，该方法诱导率最高，达93.3%，且形成的愈伤组织致密，后期形成颗粒状愈伤，有利于再分化形成不定芽。2.3-ba浓度由表3可知，在培养基中添加较高浓度的6-BA，愈伤组织块形成不定芽的比例较高，但随着6-BA浓度的进一步提高，形成的不定芽形态差、叶片弯曲畸形，出现明显的玻璃化现象。表明在愈伤组织诱导不定芽阶段，过高浓度的细胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA浓度以控制在2.0mg/L以内较为适宜。经综合考虑，以6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L的激素配比，对愈伤组织分化不定芽的效果最好，不定芽诱导率达77.8%。2.4丛生芽的增殖培养由表4可知，以在添加6-BA3.0mg/L和NAA0.2mg/L的MS培养基上，不定芽的增殖倍数最高。据观察，质地较好的愈伤组织在接种15d后，表面逐渐产生颗粒状突起，在接种20d后陆续产生丛生芽，单芽接种在此培养基上也能取得很好的增殖效果，产生的丛生芽叶色浓绿、无玻璃化现象。当6-BA浓度低于2.0mg/L时，芽增殖不明显，增殖倍数较低；当6-BA浓度达到4.0mg/L时，芽的增殖倍数并没有继续增加，反而有所降低，且芽出现畸形叶片，说明过高或过低的激素水平都不利于丛芽增殖。经综合考虑，以6-BA3.0mg/L和NAA0.2mg/L的激素配比，对不定芽的增殖效果最好，芽增殖倍数达2.65倍。3激素配比对大花葱及其他安全性芽诱导率的影响本试验以大花葱鳞球茎为外植体，对大花葱愈伤组织诱导分化以及不定芽增殖的相关技术要点进行了研究。结果表明，大花葱外植体消毒以浓度为0.1%的升汞消毒15min的消毒效果较佳，外植体成活率达62.5%；大花葱愈伤组织诱导宜采用二步法，即先在以6-BA0.5mg/L和2,4-D2.0mg/L为激素组合的培养基中培养10d，再转入MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+白砂糖30g/L培养基中，其诱导率较高，达93.3%，且形成的愈伤组织致密，后期形成颗粒状愈伤，有利于再分化形成不定芽；在愈伤组织再分化阶段，过高浓度的细胞分裂素不利于形成有效的不定芽，6-BA的浓度以控制在2.0mg/L以内较为适宜，以6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L的激素配比较为适宜，不定芽诱导率达77.8%。同时，本试验发现，在大花葱愈伤组织分化阶段，为控制玻璃