PCR测定的技术要点

1PCR测定的技术要点

白雪丽

山东省立医院检验科2PCR测定的技术要点PCR的定义PCR的基本原理PCR反应的基本成分及其对结果的影响PCR反应的基本条件及其对结果的影响PCR扩增产物的分析技术PCR技术的应用及其优缺点PCR假阳性与假阴性的预防对策3PCR简史1983年Dr.Mullis发明PCR技术1985年Saiki将PCR技术应用于镰状红细胞贫血的产前诊断1986年Erlich纯化了耐热的TaqDNA聚合酶1993年Dr.Mullis获得诺贝尔化学奖4PCR的定义PCR（polymerasechainreaction)即聚合酶链反应，是一种模拟天然DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA或RNA片段的技术。它能把极微量的遗传物质迅速而简便的扩增百万倍，使原来无法分析和检测的各种项目得以完成，它的问世，为传统基因分析和诊断技术带来了变革。5PCR的基本原理6PCR的基本原理利用

DNA分子能够变性与复性的特性，以待扩增的两条DNA链为模板，由一对引物介导，以4种dNTP为底物，经DNA多聚酶催化，在体外快速扩增特异性DNA序列

。

7PCR原理示意图90~95℃变性40~60℃退火70~75℃延伸第一循环第二循环模板变性、退火延伸第三循环变性、退火、延伸总扩增产物：2n倍增加长片段序列：2n倍增加目的DNA：2n-2n倍增加目的DNA5'3'3'5'5'3'5'3'8PCR反应的基本成分

及其对结果的影响9PCR反应的基本成分及其对结果的影响

缓冲液引物脱氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+PCR反应体系：

30~100µl10缓冲液10mmol/lTris.Cl提供适合反应的PH值（PH8.4）50mmol/lKCl促进引物退火10µg/ml明胶或血清白蛋白为Taq酶的保护剂11引物引物大小上下游引物均为人工合成20nt左右的寡核苷酸单链引物浓度一般在0.1~1µmol/l浓度过高，非特异性增加浓度过低，敏感性下降引物特异性引物特异性决定扩增的特异性，不应与非扩增区域有同源性12脱氧核糖核苷三磷酸（dATPdTTPdGTPdCTP)为DNA合成的基本原料，要求四种dNTP等浓度混合（50~200µmol/l）13模板种类DNA或RNA浓度>102copies/ml纯度标本需要纯化14TaqDNA聚合酶一般30~100µl反应体系中需加入1~2U浓度过高，非特异性增加浓度过低，产物量降低15Mg2+一般为1.5mmol/l,为Taq酶活性所必需的浓度过高，非特异性增加浓度过低，产物量降低16PCR反应条件及对结果的影响17PCR反应条件及对结果的影响变性温度与时间复性温度与时间延伸温度与时间循环数18变性温度与时间PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有模板DNA或PCR产物的双链完全解开，才能有效地和引物结合，而这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高、时间越长，变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq酶活性。常选用的循环变性温度为94℃时间30S。在PCR反应开始阶段，反应体系中主要为原始模板，链较长，一般在进行PCR循环之前，先94℃预变性10min。19复性温度与时间复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但容易出现错配，增加非特异性结合。温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右，时间30S。20延伸温度与时间引物延伸温度一般为72℃。因为在这个温度下Taq酶有较高的活性，并且引物和模板的结合较为稳定。一般72℃延伸1min对于

1kb以内的扩增片段就已足够，如果扩增片段>1kb，延伸时间可相应延长。21循环数循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。22PCRPCR扩增曲线23PCR扩增产物的分析技术24PCR扩增产物的分析技术凝胶电泳分析技术探针杂交技术25凝胶电泳分析技术主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶电泳因操作简单，较常用，一般采用浓度为1～2%的琼脂糖凝胶。通过电泳分析技术可直接观察到有无扩增产物，及产物片段的大小。可用于扩增产物的定性分析。26HCMVPCR产物电泳分析结果

594bp600bp2652bp800bp50bp350bpM12327探针杂交技术探针（probe)是通过一定手段标记的已知核酸序列。探针杂交技术的原理：在一定条件下扩增产物与其特异性同源探针可按碱基互补原则形成杂交链，通过对其中探针信号的检测来获得产物的信息。28探针杂交技术膜上杂交技术微孔板杂交技术荧光探针标记技术29膜上杂交技术通常采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。基本操作是将待测核酸片段通过凝胶电泳分离后转印到膜上或直接点样于膜上再与探针进行杂交，然后经过漂洗、显色得到检测结果。（Southern印迹、Northern印迹、斑点杂交）可对产物进行定性分析，但对操作要求较高，一般只适用于科研工作。30膜上杂交技术检测结果31微孔板杂交技术类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探针来捕获PCR产物。然后再用带有标记的检测探针与产物另一区域杂交，经过漂洗显色即可判断结果。可用酶标仪判读，用于半定量测定。但整个操作过程不是全封闭的，易造成扩增产物污染。32微孔板杂交技术原理示意图杂交杂交洗板显色杂交洗板显色33荧光探针杂交技术是近几年发展起来的一项新技术，我们通常所说的实时荧光定量PCR技术多采用的该项技术，该技术反应体系中除常规引物外，还引入了荧光基团标记的特异性探针，探针可与模板一对一结合。包括：Taqman技术Lightcycler技术Molecularbeacon技术34Taqman技术原理reporterquencher35荧光探针杂交技术优点：在全封闭条件下进行PCR定量，有效防止了扩增产物的污染。实时监测，荧光定量，结果直观，定量准确。结合了PCR技术与探针杂交技术的优点，特异性强，灵敏度高。36PCR技术的应用37PCR的应用科研：基因重组、蛋白表达DNA测序基因突变和重组的研究分子进化和种系发育的研究临床：感染性疾病的病原体检测遗传性疾病的诊断器官移植中的基因配型癌基因的检测38PCR在病原体检测中的优缺点39优点:灵敏度高102copies/ml即可，斑点杂交敏感性为105copies/ml特异性强主要由引物特异性决定，对于一个20nt的引物其非特异性配对的概率为1/420。PCR可以克服血清学诊断中存在的交叉反应可早诊断可在免疫学诊断窗口期就早期诊断不受患者免疫状态的影响PCR可对病原体进行定量分析并可对病原体进行基因分型，指导临床用药和治疗。40不足之处：操作复杂，技术不易被熟练掌握价格昂贵存在假阳性和假阴性结果41PCR假阳性和假阴性产生的

原因和预防对策42假阳性产生的原因假阳性多为污染所致，包括：产物的污染样品的交叉污染重组质粒或培养物及其它的污染43假阳性的防范措施PCR实验室要有严格的分区（试剂准备区、标本准备区、扩增区、产物检测区）要建立规范化的操作程序，并严格按程序操作。吸取标本时使用带滤塞的吸头试验前后用紫外线灯照射工作台面和室内设施注意实验室的定期通风使用防“污染”的PCR试剂(含UNG）44尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：

可防止以前扩增产物对下一次PCR反映的影响。是一个连续的防污染过程。每次实验都必须使用。一般对103~104拷贝/ml的产物污染有效。在反应体系中用dUTP代替dTTP，使产物中含大量dU，在下一次PCR反应中反应体系中加入UNG可去除dU，加热后产物链断裂，不能作为PCR反应的模板，而UNG在PCR循环高温变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影响。45

TATATATATA

PCRAUAUAU

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加热AAA

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PCR46出现污染后的对策积极寻找污染源彻底清洁工作环境、器械和仪器紫外照射工作台面及工作区彻底通风47假阴性产生的原因操作不当试剂质量差或过期仪器设备不准确其他48标本的采集和处理49标本的采集标本采集的时间标本采集部位的准备标本的类型和采集量采集标本的质量采集及运输容器标本采集中的防污染50标本采集的时间在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都会出现假阴性结果。51标本采集部位的准备采集部位的清洁消毒可去除微生物和其它杂物，但应适度，过度消毒可能会破坏靶微生物。52标本的类型和采集量标本采集类型要根据所检测的病原体而定，不同病原体存在部位不同，采集标本种类