药物靶标发现与筛选课件

药物靶标发现与筛选基因靶标核糖核酸靶标蛋白靶标药物靶标发现与筛选基因靶标1一、基因靶标1、在基因数据库中搜寻药物靶标

（1）表达序列标志(expressedsequencetag,EST)数据库（2）归纳逻辑设计程序一、基因靶标1、在基因数据库中搜寻药物靶标2EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一次测序获得的短的cDNA部分序列,代表一个完整基因的一小部分,在数据库中其长度一般从20到7000bp不等,平均长度为360±120bp。EST来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的cDNA文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。首先从样品组织中提取mRNA,在逆转录酶的作用下用oligo(dT)作为引物进行RT-PCR合成cDNA,再选择合适的载体构建cDNA文库,对各菌株加以整理,将每一个菌株的插入片段根据载体多克隆位点设计引物进行两端一次性自动化测序,这就是EST序列的产生过程。EST是从一个随机选择的cDNA克隆进行5’端和3’端单一3Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016Quantitativereal-timeRT-PCRofupregulatedordownregulatedgenesrandomlyselectedfromthelibrariesofhumannormalSN(黑质)andPD'sSNCopyrightrestrictionsmayapp4Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016ImmunohistochemicalstainingforTHandalpha-tubulinintheSNofanMPTPmicemodelTHalpha-tubulinCopyrightrestrictionsmayapp5Copyrightrestrictionsmayapply.CelldeathactivityofdifferentiallyexpressedgenesinPDUpregulatedgenesDownregulatedgenesCopyrightrestrictionsmayapp6AminoAcidSequencesofOrexins(食欲素)andOrexinReceptors(A)Structuresofmatureorexin-Aand-BpeptidesCell1998;92(4):573-585

AminoAcidSequencesofOrexin7TissueDistributionofRatprepro-orexinandOrexinReceptormRNAsA

Cell1998;92(4):573-585

TissueDistributionofRatpre8Localizationof

prepro-orexinmRNAandImmunoreactivePeptideinAdultRatBrain

Cell1998;92(4):573-585LocalizationofCell1998;92(49Up-Regulationofprepro-orexinmRNAinFastedRatsCell1998;92(4):573-585Up-Regulationofprepro-orexin10一、基因靶标2、基因芯片技术（1）普通基因芯片（2）ChIP-DSL（couplingChIPwithaDNAselectionandligationstrategy），芯片/DNA选择结扎技术一、基因靶标2、基因芯片技术11基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片的概念现已泛化到生物芯片（biochip）、微阵列（Microarray）、DNA芯片（DNAchip），甚至蛋白芯片。基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是12INH(异烟阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarrayhybridizationanalysis.用INH处理INH敏感的结核菌株(红:INH处理的;绿:INH未处理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.

用INH处理INH耐药的结核菌株用乙硫异烟胺处理INH耐药的结核菌株INH(异烟阱)-inducedmRNAexpressi13TemporalprofileofINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.TemporalprofileofINH-induce14RolesofINH-inducedgenesinthecontextofaproposedpathwayformycolicacid(结核环脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.

RolesofINH-inducedPNAS199915TheChIP-DSLschemePNAS2007;104（2):4852-4857

TheChIP-DSLschemePNAS2007;16E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

E2-inducedgeneexpressionand17E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

E2-inducedgeneexpressionand18一、基因靶标3、基因敲除（knock-out)技术一、基因靶标3、基因敲除（knock-out)技术19AninhibitoryglycinesynapseTrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286GLYT:甘氨酸酸转运子Aninhibitoryglycinesynapse20Aglutamatesynapse.TrendsPharmacolSci.2005;26(6):283-286

GMS:修饰后的NMDA受体Aglutamatesynapse.TrendsPh21FlowchartoftheKnockoutStrategyCurrBiol.2005;15(18):1663-1669

http://mendel.imp.ac.at/Pombe_deletionFlowchartoftheKnockoutStra22mde2IsRequiredforSegregationofHomologousCentromeresduringMeiosisICurrBiol.2005;15(18):1663-1669

mde2IsRequiredforCurrBiol23Deletionofmde2PermitsaStrainExpressingaRec8ProteinRefractorytoSeparaseCleavagetoUndergotheFirstMeioticDivisionwithoutPrecociousSeparationofSisterChromatids

CurrBiol.2005;15(18):1663-1669

Deletionofmde2PermitsaStr24CurrBiol.2005;15(18):1663-1669

Double-Strand-BreakFormationIsStronglyReducedinmde2Δ

CurrBiol.2005;15(18):1663-1625一、基因靶标4、检测报告基因把靶基因表达的调控序列与编码某种酶活性的基因相连转导入细胞内,通过简单地检测酶活性的变化,就可以反映化合物对转录因子和基因表达的作用性质和程度。这种能间接反映基因转录水平的编码某种酶活性的基因称为报告基因。一、基因靶标4、检测报告基因把靶基因表达的调控序列与编码某种26StructureofSB247464Science.1998;281(5374):257-259

StructureofSB247464Science27ActivityofG-CSF(粒细胞集落刺激因子)andSB247464

inNFS60cellluciferaseassaysScience.1998;281(5374):257-259

ActivityofG-CSF(粒细胞集落刺激因子)a28PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464

orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259

PhosphorylationofsignalingS29ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.1998;281(5374):257-259未转染受体转染CSF受体ThemurineG-CSFreceptorconf30GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464

invitro.GranulopoieticactivityofSB247464

invivo.Science.1998;281(5374):257-259Granulocyticcolonyformation31一、基因靶标5、低等生物功能基因组筛选一、基因靶标5、低等生物功能基因组筛选32

DrugentryrouteintoC.elegans(秀丽隐杆线虫)NatRevDrugDiscov2006;5:387-398DrugentryrouteintoC.eleg33TheserotonergicsynapseofC.elegans.NatRevDrugDiscov2006;5:387-398TheserotonergicsynapseofC.34OverviewoftheRNAinterferencesupportedtargetidentificationprocessNatRevDrugDiscov2006;5:387-398OverviewoftheRNAinterferen35

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398Chemicalgeneticsasatoolf36

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398Chemicalgeneticsasatoolf37ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419CuringofanematodeE.faecalisinfectiononsolidmediumbyantibiotictreatmentTet:四环素Cipro:万古霉素Van:环丙沙星ProcNatlAcadSciUSA.200638ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419TheliquidinfectionassaygaugesdifferencesinnematodekillingduetoE.faecalisstrainswithvaryingdegreesofpathogenicityorduetoantibiotictreatment.Cyl:溶细胞素Amp:氨苄青霉素ProcNatlAcadSciUSA.200639Scoringlive/deadwormsintheliquidkillingassay

ProcNatlAcadSciUSA.2006;103(27):10414-10419Scoringlive/deadwormsinthe40二、核糖核酸靶标1、核酶技术

二、核糖核酸靶标1、核酶技术41核酶(ribozyme)

核酶:用于描述具有催化活性的RNA,即化学本质是核糖核酸(RNA)，却具有酶的催化功能。

核酶(ribozyme)核酶:用于描述具有催化活性42●内含子(intron)内含子是基因内的间隔序列，它不出现在成熟的RNA分子中，也就是说在转录后要通过加工被切除。●外显子(exon)最后出现在成熟RNA中的基因序列。药物靶标发现与筛选ppt课件43●核酶的发现:1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜虫的26SrRNA前体加工去除基因内含子时获得一个惊奇的发现∶内含子的切除反应发生在仅含有核苷酸和纯化的26SrRNA前体而不含有任何蛋白质催化剂的溶液中，可能的解释只能是:内含子切除是由26SrRNA前体自身催化的，而不是蛋白质。●核酶的发现:44●核酶的证实为了证明这一发现，他们将编码26SrRNA前体DNA克隆到细菌中并在无细胞系统中转录成26SrRNA前体分子。结果发现这种人工制备的26SrRNA前体分子在没有任何蛋白质催化剂存在的情况下，切除了前体分子中的内含子。这种现象称为自我剪接(self-splicing)，这是人类第一次发现RNA具有催化化学反应的活性，具有这种催化活性的RNA称为核酶。ThomasCech因发现了核酶而获得1989年诺贝尔化学奖。●核酶的证实45内含子的切除:核酶的作用机理

除了rRNA前体中有内含子,tRNA和mRNA前体中都有内含子的存在,这些内含子都要通过加工被切除,才能得到成熟的rRNA、tRNA或mRNA。虽然这些RNA中内含子切除的机理各不相同,但都涉及到核酶的作用。内含子的切除:核酶的作用机理除了rRNA前体中有内46核剪接(nuclearsplicing)

真核生物的结构基因中一般都含有内含子，转录后，从pre-mRNA中将内含子切除，然后将外显子重新连接成一个成熟的mRNA的过程称为RNA剪接(RNAsplicing)。

鸡的卵清蛋白基因中有7个内含子，转录后需要被切除，8个外显子连接起来形成有功能的mRNA。核剪接(nuclearsplicing)真核生物的47药物靶标发现与筛选ppt课件48鸡的卵清蛋白基因初始RNA转录物的剪接

鸡的卵清蛋白基因初始RNA转录物的剪接49核酶种类:发卡状核酶锤头状核酶I型内含子核酶RnaseP核酶丁型肝炎病毒核酶核酶种类:50RibozymedesignandgeneactivationNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141

Ribozymedesignandgeneactiv51Ribozyme-mediatedphenotypealterationonindicatormedia.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141

Ribozyme-mediatedphenotypeal52Testfortarget-independentgrowthonselectivemedia.NucleicAcidsRes.2002;30(24):e141Testfortarget-independentNuc53RelativegrowthrateofstrainsexpressingribozymeswithDTAsequencesasthe3′exonNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141Relativegrowthrateofstrain54二、核糖核酸靶标2、反义寡核苷酸

二、核糖核酸靶标2、反义寡核苷酸55

反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,asON)人工合成的，与靶基因或mRNA某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上,从而封闭基因的表达。包括：反义DNA，反义RNA，其来源可有人工合成和体内表达两类。反义寡核苷酸(antisenseoligonucle56

反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重要工具。大多数药物属于靶标基因（或疾病基因）的抑制剂，因此反义寡核苷酸模拟了药物的作用，这功能丢失（LOF)的研究方法比传统的功能获得（GOF)方法更具优势。同时，那些在靶标实验中证明有效的反义寡核苷酸本身还可以被进一步开发成为反义寡核苷酸药物。反义寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一种研究基因功能的重57

Table1.

PS-ODNstargetingtheM.tuberculosis30,32A,and32Bprotein(分枝酰基转移酶)genetranscripts

mRNAtarget5'

3'PS-ODN5'

3'30-kDaprotein

30:1–24AATCTTTCGGCTCACGTCTGTCAT

30:HP2/HP1GCGCATATGCGCAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATGCGCGCGC

30:1–24-MMAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtT

30:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTGCGCGCGC32A-kDaprotein

32A:1–24ACGAACCCTGTCAACAAGCTGCAT

32A:HP2/HP1GCGCATATGCGCACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATGCGCGCGC

32A:1–24-MMAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtT

32A:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtGAtCCaTGcCAgCAtGCaGCtTGCGCGCGC32B-kDaprotein

32B:1–24TCGCACCTGTTCGAAGAACGTCAT

32B:HP2/HP1GCGCATATGCGCTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATGCGCGCGC

32B:1–24-MMTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtT

32B:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTGCGCGCGCPS-ODNs:antisensephosphorothioateoligodeoxyribonucleotides;MM:错配的核苷酸HPS-ODNs:5`-,3`-hairpin-modifiedPS-ODNs发夹修饰的反义寡核苷酸

Table1.PS-ODNstargetingth58InhibitionofM.tuberculosisgrowthbyantisenseHPS-ODNsspecificforthe30/32-kDaproteingenecomplex.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204InhibitionofM.tuberculosis59SpecificinhibitionofproteinsynthesisbyantisenseHPS-ODNs.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204Specificinhibitionofprotein60Inhibitionof30,32A,and32BproteingenetranscriptsynthesisProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204Inhibitionof30,32A,and32B61HPS-ODNinhibitionofM.tuberculosismultiplicationinhumanmacrophagesProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204HPS-ODNinhibitionofM.tuber62二、核糖核酸靶标3、RNA干扰技术

二、核糖核酸靶标3、RNA干扰技术63转录后基因表达抑制现象的发现＋CHSGene矮牵牛花(Jorgensen,R,1990)CHS:与色素合成相关的酶,以加深花的颜色转录后基因表达抑制现象的发现＋CHSGene矮牵牛花(Jo64RNAi现象的发现线虫（C.elegans)(AndrewFire,1998)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA线虫，果蝇微生物，植物

失败的原因:在合成反义RNA时存在技术问题,用于注射的正义和反义RNA中都混有少量双链RNARNAi现象的发现线虫（C.elegans)(Andre65dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表达的机理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNADicer:是一种核酸酶,将双链RNA降解成21-23bp的小干扰RNARISC:RNA诱导的沉默小体,他是由单链siRNA与一些蛋白形成的复合体dsRNADicercleavageofdsRNAsi66RNA干扰(RNAinterference,RNAi)RNAi是将一段双链的RNA序列导入机体或细胞中,机体或细胞中与之有同源序列的基因的表达将会受到抑制,甚至表达受到完全抑制RNA干扰(RNAinterference,RNAi)67DecreasedhumanMKexpressioninPC-3cellstransfectedwithvarioussiRNAsCancer.2006;107(4):864-873

MK:肝素结合细胞因子DecreasedhumanMKexpression68EffectoftreatmentwithMKsiRNAcombinedwithPTX(紫杉醇)onPC-3cellviabilityandanchorage-independentgrowthCancer.2006;107(4):864-873

PTX:siRNA-SCR:乱序siRNSEffectoftreatmentwithMKsi69DeterminationofasuitabledoseandthedurationofthesiRNAtodownregulateMKinPC-3xenograftsCancer.2006;107(4):864-873

Determinationofasuitabledo70AntitumoreffectofMKsiRNAinPC-3xenografts.Cancer.2006;107(4):864-873

AntitumoreffectofMKsiRNAi71三、蛋白质靶标1、抗体和胞内抗体

三、蛋白质靶标1、抗体和胞内抗体72药物靶标发现与筛选ppt课件73抗体除对组织和细胞中特异性抗原进行定位外，尚有强大的中和能力阻断蛋白质功能。对于细胞内的靶分子，需要以合适的方式将抗体导入细胞。显微注射是一种将抗体注入细胞的方式，但是这种方式难以做到高通量，影响了药物靶标发现验证的速度。为了满足高通量研究的需要，Moris创建了一套化学试剂方法将抗体导入细胞，而抗体的功能和细胞的活性不受影响。另一种将抗体导入细胞的方式是让抗体在细胞内表达(intrabodies)，其中包括使用灭活病毒的方法。抗体除对组织和细胞中特异性抗原进行定位外，尚有强大的中和能力74Abispecific,tetravalentintradiabodyJBiolChem.2003;278(48):47812-47819Abispecific,tetravalentintr75IntrabodyandTie-2/VEGF-R2colocalizationonHUVECJBiolChem.2003;278(48):47812-47819IntrabodyandTie-2/VEGF-R2J76A,kineticsofsurfaceexpressionofTie-2andVEGF-R2aftergenetransferoftheintradiabodyandconventionalscFvintrabodiesonHUVECusingrecombinantadenoviruseswithanMOIof10B,genetransferofintrabodiesdirectedtohumanTie-2,VEGF-R2,orTie-2/VEGF-R2byrecombinantadenovirusesonday6afterinfectionJBiolChem.2003;278(48):47812-47819A,kineticsofsurfaceexpress77Inhibitionofcapillarytubeformationinvitro

JBiolChem.2003;278(48):47812-47819

Inhibitionofcapillarytubef78三、蛋白质靶标2、生色团辅助激光灭活(chromophore-assistedlaserinactivation,CALI)

三、蛋白质靶标2、生色团辅助激光灭活(chromophore79CALl能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化进行检测。将标记有孔雀绿染料的非功能灭活抗体与特异性蛋白质结合，然后对蛋白质复合物进行激光照射。染料受激光激发短暂的产生活性分子，对结合的蛋白质造成破坏而起到灭活作用，但不影响其他蛋白质组分。CALl能够直接对蛋白质进行操作，而不是通过对蛋白质量的变化80AlentiviralsystemforsimultaneousknockdownandrescuewithafunctionalEGFP-fusioncomplement.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707Alentiviralsystemforsimult81CALIofEGFP-CPinducestheformationofdorsalrufflesandfilopodiaonlyintheknockdown/rescuebackground.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-CPinducesthefo82CALIofEGFP-CPinKDRcellsgeneratesalocalincreaseinbarbedendsofactinfilamentsanddorsalF-actin.

ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-CPinKDRcellsg83CALIofEGFP-MenainMena/VASP-deficientcellsinducesmorestablelamellipodialprotrusionsProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707CALIofEGFP-MenainMena/VASP84三、蛋白质靶标3、蛋白质组技术

三、蛋白质靶标3、蛋白质组技术85基因基因是一段DNA（脱氧核糖核酸分子）双链。－碱基成对出现:ATCGGCCTAGCCGG基因基因是一段DNA（脱氧核糖核酸分子）双链。86基因表达中的信息流中心法则（TheCentralDogma）基因表达中的信息流中心法则（TheCentralDogm87蛋白质翻译蛋白质翻译88蛋白质结构的层次一级结构

-氨基酸序列二级结构

-主要由氢键稳固的局部构象，如

-helix,

-sheet等三级结构

-三维构象四级结构

-多个多肽链的组合蛋白质结构的层次一级结构89蛋白质结构的图形描述分子表面-分子可视化-分子对接-基于结构的药物设计-…蛋白质结构的图形描述分子表面90蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的91生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样92蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转93蛋白质二维电泳：蛋白质提取样品前处理一向等电聚焦二向SDS—PAGE凝胶银染及扫描双向电泳分析软件分析差异蛋白质点的质普分析生物信息数据查询、建立蛋白质数据库蛋白质二维电泳：蛋白质提取样品前处理一向等电聚焦二向SDS—94双向电泳分析中的样品制备制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。双向电泳分析中的样品制备制备原则：95可溶性样品

固体组织样品

细胞不同样品的基本处理方法样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。可溶性样品固体组织样品细胞不同样品的基本处理方法样品的分96样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。97增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或

-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。增加样品溶解性的手段变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质98起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下99样品中核酸的去除对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。样品中核酸的去除对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合100亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。亚蛋白质组样品的制备用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等101特殊样品的制备

低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级＋窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。

特殊样品的制备低丰度蛋白的分离：尽管增加上102强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcylsulfateions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用103垂直板凝胶电泳装置加样样品迁移方向垂直板凝胶电泳装置加样样品迁移方向104电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶

按分子大小分离电泳方向

电泳

小分子大分子电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝105夹在两块玻璃板之间的凝胶

电泳缓冲液

电泳缓冲液

加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳缓冲液加在槽106电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片107标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。

相对迁移率标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数108水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶109B.等电聚焦电泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI相一致的pH处。凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）

加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度

加样品，然后继续电泳凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布B.等电聚焦电泳（IFE）凝胶中加有两性电解质溶液（pH110等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pH等电聚焦电泳进行过程中等电聚焦电泳结束后（＋）（＋）（－）（111C.双向电泳第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳第二向电泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3C.双向电泳第一向电泳：等电聚焦电泳聚焦后凝胶放置在SD112大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片113蛋白质的胶内酶切包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程蛋白质的胶内酶切包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的114质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程样品制备与IPG胶条水化IPG电泳与上样缓冲液浸润SDS转PVDF膜胶内直接染色染色取出蛋白点胰酶等消化浓缩于多孔吸附柱上MALDI-MS肽指纹图数据库查询蛋白质鉴定已知反向HPLC分离MALDI-MS，PSD片段分析示知ESI-MS-MS、微测序质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程样品制备与IPG胶条水化115实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）肽混合物质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法蛋白质序列数据库（＋核酸序列翻译数据库）肽质量检索：片1.ppt

未解析碎片离子检索：片2.ppt酶切质谱鉴定蛋白质的策略实验方法肽混合物质谱测定肽质量选择肽段裂解计算方法肽质量检索116体外pmol[32P]蛋白质标记蛋白质分离蛋白酶切2D磷酸化做图LC-ESI-MS或MALDI-MSLC-ESI-MSHPLCIMAC磷酸化氨基酸分析体内[32P]细胞标记蛋白酶切2D磷酸化做图相关分析磷酸化位点分析策略体外pmol[32P]蛋白质标记蛋白质分离蛋白酶切2D磷酸117非变性2D：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是一样的；非变性/SDS-2