CML的实验室检测

CML的实验室检测概述道培血液•肿瘤中心刘红星2014-09-21@北京CML的病因和治疗BCR-ABL1DNABCR-ABL1mRNA≈0.1-1KBCR-ABL1Protein≈n*0.1M主要代谢酶：CYP3A4抑制：CYP2C9；CYP2C19TKIs血浆药物浓度TKIs持续增殖凋亡抑制CML的主要实验室检测项目项目检测灵敏度优点缺点其它血常规初诊时常可目测到白细胞数目的增加费用低特异性差血细胞形态可反映CP、AP、BC直观的骨髓和外周血细胞检查非特异，检测灵敏度有限染色体核型10-1可反映附加的染色体异常；可反映AP、BC灵敏度有限，报告周期长，有一定的培养失败率FISH10-3特异、可反映细胞内BCR-ABL1扩增费用较高，检测灵敏度有限多用作验证检测RQ-PCRBCR-ABL1

mRNA10-4.5-10-5.5灵敏度高，特异性好，报告快对质控要求严格；定量值不直接反映细胞数的比例TKIs耐药突变15-20%；2-5%检测主要的耐药原因；指导换药耐药因素之一TKIs血药浓度10ng/ml--辅助个体化用药CYP3A4基因遗传多样性综合的影响因素辅助个体化用药CP:慢性期；AP:加速期；BC:急变期；FISH:荧光原位杂交RQ-PCR定量检测

BCR-ABL1mRNA为什么RQ-PCR检测灵敏度更高？BCR-ABL1

mRNAABL1mRNA各约≈n*1KBCR-ABL1DNA常规取2-5×106细胞起始约2-5×108-9个目标分子混匀在一起供下游检测裂解细胞抽提mRNA染色体核型：需要对每个细胞的所有染色体进行人工分析，常规分析20个细胞的核型RQ-PCRFISH：需要人工每个细胞的杂交信号，常规浏览数千个细胞，分析300-500个细胞。转化为荧光信号进行定量和比例分析RQ-PCR的影响因素细胞裂解提取RNA有核细胞悬液制备反转录（R）Q-PCR和定量信号分析起始标本量；疾病状况；标本保存、运输；制备的细胞质量RNA提取效率，完整程度（不易保证和评估）反转录效率（不易评估）RNA极易降解，对操作人员和实验室质控要求高目的基因和内参基因的扩增效率差异；分析参数的设置；标准品拷贝数的准确性反转录酶、扩增酶、引物、探针等各种生化试剂的质控保证，每一环节出错都可导致假阴性PCR的独特特点：对目标分子扩增百万倍，容易造成小分子的扩增产物污染，导致假阳性RQ-PCR的影响因素定量结果不直接反映肿瘤细胞比例：细胞结构被破碎，单个细胞的目的基因和内参基因表达的mRNA分子数存在变数。定量过程中的指数换算，导致内参基因和目的基因扩增效率的微小差异会对结果有显著影响。标本处理和反转录步骤主要影响检测灵敏度；定量值准确性主要受Q-PCR时扩增效率的差异影响。虽然影响因素复杂多样，但如果熟知各环节的影响因素，做好质控，需要时有能力根据标本情况调整实验细节，生物实验仍可有非常好的重复性。KonstantinB.Ignatov,etal.BioTechniques2014:57:81-87MinamiF.Yamada,etal./10.1620/tjem.214.97RQ-PCR定量值的国际标准化（IS）主要是为了不同实验室间的检测结果可比CF:各实验室的转换系数；IS:国际标准化值主要是报告检测值的可比性，和检测灵敏度无关尤其各实验室间检测方案不同时需要前提是各实验室各自的检测结果稳定、重复性好目前国内绝大多数实验室都采用EAC-2003方案理论上采用同一定量方案的实验室间应该具有比较天然的可比性EuropeAgainstCancerProgramLeukemia(2003)17,2318–2357RichardD.Press,etal.JMolDiagn2013,15:565-76MinamiF.Yamada,etal./10.1620/tjem.214.97标本送检：骨髓还是外周血？SBranford,etal.Leukemia(2006)20,1925–1930Adelaide实验室进行的一项24例CML患者的PB/BM对照检测：3例患者检测结果有持续的差异；其它11例患者有至少1次出现检测值差异。认为由于取材方便，PB仍可作为常规检测的标本。BCR-ABL1定量报告O'HareT,etal.NatRevCancer.2012;12(8):513-26.反映本次检测的灵敏度ABL1内参数>31250BCR-ABL1定量值:降的越快越安全肿瘤发生、发展的一般规律，治疗反应快的患者：可能除BCR-ABL1外的其它伴随突变相对较少、基因组不稳定因素较少。残存的肿瘤细胞少，出现继发突变的概率减低。BaccaraniM,SoveriniS.Blood.2014;124(4):469-71TKIs耐药突变TKIs耐药突变和检测方法学Cowan-Jacobetal.MiniRevMedChem2004;4:285-99大多数用基因测序法，激酶区全长的突变均可分析适用于目前所有的ABL1-TKIs特异性检测BCR-ABL1的激酶区：有融合基因即可测序BCR-ABL1定量为阴性时，也有可能可完成检测基因突变的检测灵敏度（占所有BCR-ABL1的比例）1代测序的突变检测灵敏度约15%2代测序可达2-5%；更高度灵敏度意义不大耐药突变产生的内在原因CML肿瘤干细胞的基因组不稳定性是TKI耐药突变、IKZF1缺失、TP53突变的内在原因。Imatinib可以抑制BCR-ABL1，但并不能抑制CML肿瘤干细胞中的氧自由基和DNA的氧化损伤。激酶活性1mMimatinib28h后氧自由基DNA氧化损伤ElisabethBolton-Gillespie,etal.Blood.2013;121(20):4175-83*P<.01incomparisonwithuntreatednormalcells,**P<.05incomparisonwithuntreatedCML-CPcellsandnormalcells,and***P<.05incomparisonwithuntreatedCML-CPcells.Imatinib增加CML肿瘤干细胞中

氧自由基和DNA氧化损伤

激酶活性CML/对照氧自由基增加倍数DNA氧化损伤健康对照CML-CP小鼠P=0.039P=0.028P=0.010P=0.017P=0.002P=0.031ElisabethBolton-Gillespie,etal.Blood.2013;121(20):4175-83DrugResistanceandBCR-ABLKinaseDomainMutationsinPhiladelphiahromosome–PositiveAcuteLymphoblasticLeukemia;FromtheImatinibtotheSecond-GenerationTyrosineKinaseInhibitorEraSimonaSoverini,etal.Cancer2014;120:1002–9.Dasatinib突变谱与Imatinib显著不同，

但突变耐药仍是个问题SimonaSoverini,etal.Cancer2014;120:1002–9.换用二代TKIs后基因突变的动态变化SimonaSoverini,etal.Blood.2013;122(9):1634-48耐药突变动态变化的根源在于耐药性的差别AnnaLau,KarenSeiter,etal.ClinicalLymphoma,Myeloma&Leukemia,2014,14(3):186-96TKIs耐药突变的出现和消长突变的产生基于肿瘤干细胞的基因组不稳定性不管是否