13 载脂蛋白E基因检测标准操作流程

载脂蛋白E基因多态性检测标准操作规程一、检验目的为保证本实验室检测载脂蛋白E(ApoE)基因型时DNA提取、PCR扩增及扩增产物杂交、显色、芯片扫描实验操作的标准化，确保检测结果的准确性、重复性，制定本规程。二、适用范围适用于血液样本基因组DNA的提取、PCR扩增、杂交显色及报告。三、方法原理采用基因芯片技术，测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列。载脂蛋白E(ApoE)是一种由299个氨基酸残基组成的蛋白质，与脂质转运和代谢密切相关，参与众多疾病的发生、发展和预后。其生理和病理功能的体现，主要取决于氨基酸残基的差异，而不是血清中ApoE含量的高低。ApoE基因共有三个等位基因，分别为&2、&3和&4,并由此组合成6种基因型，即ApoE&2/2、&3/3、&4/4三种纯合子和ApoE&2/3、&2/4、&3/4三种杂合子°ApoE通过其与受体结合，决定了乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDLs)、高密度脂蛋白(HDL)等脂质的降解，在脂蛋白代谢中发挥着重要的作用，其代谢和降解的速率，直接与APOE与其受体的亲合能力有关。不同的ApoE基因型与相应的配体具有完全不同的亲合力，不同型间的差异高达100倍，进而对CM、VLDLs和HDL的分解代谢形成完全不同的影响。&2与LDL受体亲结合力最低，因而&2等位基因携带者其血液中总胆固醇(TC)、LDL-C浓度低，易患III型高脂血症；&4与LDL受体亲合力最高，因而&4等位基因携带者其血液中TC、LDL-C浓度高，易患冠心病、脑梗死、阿尔兹海默症等疾病。由于ApoE基因型别的不同，影响了系列疾病的发生风险及预防保健方式。因此，早期检测ApoE基因型，将有助于我们终身的疾病预防和健康管理。四、性能指标最低检出限：2ng/ul基因组DNA。准确度：以浓度为50-70ng/ul的&2/2、&3/3、&4/4和ApoE&2/3、&2/4、&3/4各3种基因型的DNA样品分别检测试剂盒，结果符合相应型别；以10份企业标化的阴性质控品进行平行两次检测，结果一致且均为阴性；以6-10ng/ul的ApoE&2/3、&2/4、&3/4杂合基因型的DNA样品分别检测试剂盒，结果符合相应位点基因型别。2.精密度：以浓度为20-40ng/ul的ApoE&2/3、&2/4、&3/4杂合基因型的DNA样品分别分别对同一批试剂盒平行检测20次，每天4次，分为5天，检测结果一致。五、标本收集标本类型：静脉血的全血标本作为检测标本(抗凝剂为EDTA，抗凝剂的质量应符合化试药品要求——化学纯或分析纯，使用的比例以厂家推荐为准)。标本保存室温保存不超过7天，2〜8°C不超过1个月，-20°C不超过7周，反复冻融不超过5次，全血的运输必须遵守国家相关规定。标本拒收与1、2所述不符的标本，检验人员应向临床或就诊者说明拒收标本的原因，并提出解决方案或建议，并做好相关记录。试剂的分装：扩增液(1、2、3)融溶后，将其分装到0.2ml离心管中，22^1/管。试剂的贮存：扩增液、阳性对照液、阴性对照液2〜8°C贮存不超过1周，-20°C可贮存至效期;反应液A在-20C贮存。各组分在-20C贮存期间，冻融次数不超过5次。扩增产物短时间内可于2-8C保存。六、试剂盒及仪器组成台式高速离心机：离心速度能够达到12,000rpm(9,500Xg)恒温金属浴或水浴箱(温度范围至少应包括56C)涡旋振荡器移液器：规格为1ml、200山及100山紫外分光光度计：检测波长范围至少应涵盖260nm及280nm血液基因组DNA提取试剂盒(这里以BaiO®DNA提取纯化试剂盒为例)PCR仪：有热盖，使用0.2ml离心管台式离心机(可以对0.2ml离心管瞬时离心)琼脂糖凝胶电泳仪移液器：规格为100卩1,20卩1,2.5卩1BaiO®载脂蛋白E(ApoE)基因检测试剂盒(PCR-芯片杂交法)移液器：规格为1ml,200卩1,10卩1BaiO®载脂蛋白E(ApoE)基因检测试剂盒(PCR-芯片杂交法)BaiO®BR-526-24全自动杂交仪BaiO®BE-2.0生物芯片识读仪BaiO®基因芯片图像分析软件BaiO®载脂蛋白e(ApoE)基因型分析软件七、标本处理及扩增操作程序1、基因组DNA提取处理血液材料做载脂蛋白E(ApoE)基因型检测时，只需用200卩1血液即可。当血液样品体积小于200卩1时，可加适当体积PBS调整至200卩1再进行下一步实验。活化吸附柱吸附柱在使用前需要活化，活化方法：将吸附柱置于收集管中，加入500卩1缓冲液BH1，静置2-3min,12,000rpm(9,500xg)离心30s；弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，在吸附柱中加入500卩1缓冲液BH2,12,000rpm（9,500xg）离心30s,弃去收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中待用。1.3取1.5ml离心管，做好标记，每管中加入20口丨蛋白酶K溶液。1.4加入200口丨血液样品（注意：在加入血液样本之前一定要把全血充分混匀）。1.5加入200口丨缓冲液BL,振荡15秒，混匀。低速离心，使管壁血液离心至底部（注意：不可将缓冲液BL直接加入蛋白酶K中）。1.656°C放置10分钟。1.7加200口丨无水乙醇，振荡15秒，混匀，低速离心。1.8将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个已活化的吸附柱中（吸附柱放入收集管中），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500Xg）离心1min，弃去装废液的收集管，将吸附柱插入新的收集管中。1.9向吸附柱中加入500口丨缓冲液BW1（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500Xg）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入500口丨缓冲液BW2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），不要弄湿管口，12,000rpm（9,500Xg）离心1min，倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管中。将吸附柱放回收集管中，12,000rpm（9,500Xg）离心1min，以彻底去除吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60口丨洗脱缓冲液BE，室温（推荐56C）放置5min，12,000rpm（9,500Xg）离心1min，将溶液收集到离心管中。2、PCR扩增2.1取出原先分装好的扩增液，在管内按照如下体系配制PCR反应液，并做好标记。每人份检测使用1管扩增液1（22口丨/管）、1管扩增液2（22口丨/管）和1管扩增液3（22口丨/管）。扩增1：试剂体积（门基因组DNA

扩增液1反应液A221总体积25扩增2：试剂体积（卩1）基因组DNA2扩增液222反应液A1总体积25扩增3：试剂体积（卩1）基因组DNA2扩增液322反应液A1总体积252.2将各0.2ml离心管放入PCR仪中，按下列条件扩增：50°C5min；94°C5min；94°C30sec,59C30sec,72C30sec,35cycles；72C5min。2.3取出扩增产物，2〜8°C保存。3、杂交显色3.1取出BaiO®杂交显色试剂盒。将反应液B低速离心，吸取10卩1加入杂交缓冲液瓶中混匀，备用。3.2配制杂交反应液：吸取170pl杂交缓冲液加入到8联管中的对应位置，再向其中加入10卩l扩增1产物、10pl扩增2产物和10pl扩增3产物，混匀。3.3临用前，取出1支抗体，低速离心，加入1ml抗体稀释剂，振荡混匀，制成抗体使用液，吸取200pl加入到8联排管中的相应位置，剩余试剂-20°C保存。3.4向8联排管中的相应位置加入200pl显色液。3.5取出载脂蛋白E（ApoE）基因芯片，做好标记，将基因芯片（标签面朝上）放入芯片卡槽内，确保芯片与温控平台平齐、贴紧，关上反应舱压盖。注意：芯片装载时应平行插入，芯片装载的位置编号须与试剂托架上对应的试剂管所放置编号一致。3.6将加好试剂的8联排管逐一装载在试剂托架上。注意：排管的装载方向及编号，并保证装载完毕后各8联排管在同一高度上。3.7点击“关闭"按钮，关闭试剂舱。3.8点击软件运行窗口各区域（A/B/C）温控状态栏上的“加载"按钮，载入“载脂蛋白E-41度.scri”程序，确认流程加载完毕，试剂及芯片也装载正确后，点击“运行”按钮开始实验。4、扫描4.1杂交反应结束后，取出芯片，用蒸馏水冲洗芯片表面，自然晾干。4.2启动BE-2.0生物芯片识读仪将计算机与本仪器各组件连接好后，打开仪器电源开关，此时扫描仪启动4.3运行ArrayDoctor软件扫描仪启动1分钟后，双击计算机桌面上的ArrayDoctor图标，运行ArrayDoctor软件。显示屏出现ArrayDoctor软件主页面（下图）。4.4放置芯片向下拨动检测窗开启按钮，打开检测窗盖，将芯片欲扫描面（带“BaiO”标签面）朝上，平整的置于检测窗的片槽内，注意，将有“BaiO”字样标签一

端朝开盖的方向。轻轻闭合检测窗盖。4.5图像扫描点击工具栏右侧的下拉列表框并选择芯片种类，在芯片种类中选择“载脂蛋白E(ApoE)基因检测试剂盒”。b.单击ArrayDoctor软件工具栏上的“预扫描”按钮，软件自动开始预扫描并在计算机屏幕上输出预扫描图像和一个方框(下图)c.用鼠标左键拖动方框至要扫描的区域d.单击ArrayDoctor软件工具栏上的“扫描”按钮，扫描仪开始扫描，并将

待测图像输送至计算机屏幕（下图）。4.6图像分析a.用鼠标右键单击图像，出现一网框，用鼠标左键移动网框，使每个圆点处于一个网格中。点击ArrayDoctor软件工具栏上的“寻点”按钮，各圆点被选中，如果发现因为背景信号使信号点选歪（罕见），可以用鼠标移动至正确位置。AzrayDoctorAzrayDoctor-c:Variaydsctor1BbipS.5:ViIMI•T打开雖扫摘另存为才点廿'I：'：Z5：1璋刃忙：；|：吃：贝：,_背|啸•••••OOO■•••••ooo•••ooo・・・♦e«ooo**»♦•oooee・■・・<weooo•••oooooo•••oooooo选点完成后单击ArrayDoctor软件工具栏上的“分析”按钮，软件将自动输出检测报告。4.7检测图像的保存分析完成后，点击工具栏上的“保存”按钮，可直接保存图像。4.8检测报告的保存和打印检测报告为excel格式，对检测报告的保存或打印可以在excel软件中完成。八、实验结果分析及判定ApoE基因共有三个等位基因，分别为&2、&3和&4,并由此组合成6种基因型，即ApoE&2/2、&3/3、£4/4三种纯合子和ApoE&2/3、&2/4、£3/4三种杂合子oApoE通过其与受体结合，决定了乳糜微粒(CM)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDLs)、高密度脂蛋白(HDL)等脂质的降解，在脂蛋白代谢中发挥着重要的作用，其代谢和降解的速率，直接与APOE与其受体的亲合能力有关。不同的ApoE基因型与相应的配体具有完全不同的亲合力，不同型间的差异高达100倍，进而对CM、VLDLs和HDL的分解代谢形成完全不同的影响。&2与LDL受体亲结合力最低，因而£2等位基因携带者其血液中总胆固醇(TC)、LDL-C浓度低，易患III型高脂血症；£4与LDL受体亲合力最高，因而£4等位基因携带者其血液中TC、LDL-C浓度高，易患冠心病、脑梗死、阿尔兹海默症等疾病。由于ApoE基因型别的不同，影响了系列疾病的发生风险及预防保健方式。因此，早期检测ApoE基因型，将有助于我们终身的疾病预防和健康管理。九、室内质控及失控处理由于暂无室内质控来源，暂不设定室内质控物，由试剂盒自带阳性对照代替。十、注意事项杂交显色试剂盒(含抗体)、基因芯片2〜8°C贮存，有效期12个月。反应液B在2〜8°C贮存不超过1周，-20C贮存至有效期，冻融次数不超过5次。试剂的分装：扩增液（1、2、3）融溶后，将其分装到0.2m1离心管中，22卩1/管。试剂的贮存：扩增液、阳性对照液、阴性对照液2〜8°C贮存不超过1周，-20°C可贮存至效期；反应液A在-20C贮存。各组分在-20C贮存期间，冻融次数不超过5次。扩增产物短时间内可于2-8C保存。PCR反应试剂的分装、加样应在一相对独立试验区域内进行，可与样品DNA的提取在一个区域内进行，实验进行时所需设备和试剂均应存于该区。样本DNA的提取应在相对独立试验区域内进行，可与PCR反应的加样在一个区域内进行，实验进行时所需设备和试剂均应存于该区。PCR、芯片杂交显色、扫描，及相关仪器试剂的存放应在另一个相对独立区中进行。各区的移液器、枪头、离心管不可互换使用，防止交叉污染。进入杂交区的人员应避免再次进入DNA提取及PCR加样区。血液基因组DNA提取试剂在室温（15-25C）干燥条件下，可保存12个月；更长时间的保存可置于2-8C。若缓冲液BL中有沉淀，可在56C水浴中重新溶解，摇匀后使用。使用前请先在缓冲液BW1和缓冲液BW2中加入适量无水乙醇，加入体积请参照瓶上标签。提取的基因组DNA应保存在-20°C。十一、参考范围暂无十二、质量控制1.DNA片段可用紫外分光光度计检测DNA浓度及纯度，DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD26o/OD28o的比值应为1.5-2.0。OD260值为1相当于大约50yg/ml双链DNA。DNA浓度应在10-60ng/y1为宜。2•在做PCR实验时可设置阳性对照和阴性对照［载脂蛋白E（ApoE）基因检测试剂盒（PCR-芯片杂交法）附带］,PCR反应后可将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，阴性对照应检测不出DNA，阳性对照应检测出较明显的DNA条带，且在后面的杂交实验中会检测出该阳性对照基因型。芯片上阵列内每个探针重复次数为6个点。在正常检测条件下，样点形状规则，无明显拖尾。如遇检测结果阴性，必须重复检测。检测中质控探针应为阳性，否则应检查杂交显色操作是否正确。如操作正确，请与试剂供应商联系。对首次使用本试剂盒的实验室和实验人员，应进行阳性对照品和阴性对照品实验，以确保实验条件和操作符合要求。正常检测时，也应定期进行阳性对照品和阴性对照品实验。阳性对照使用方法：取阳性对照作为样品DNA溶液，按照PCR到杂交显色步骤进行操作。8•阴性对照使用方法：取阴性对照作为样品DNA溶液，按照上述杂交步骤进行操作。检测结果应为“未检出”。十三、临床意义1、ApoE基因型与心脑血管疾病冠状动脉粥样硬化性心脏病（CHD）成为导致我国人群死亡的主要疾病之一，心肌梗死（Ml）是CHD中最严重的一型，严重危害人们的生活、健康和寿命。高脂血症是其发生的重要危险因素。载脂蛋白E（ApoE）作为多种脂蛋白的结构成分，具有明显的基因遗传多态性，其参与脂类的运转和代谢，与脂代谢紊乱、CHD和动脉粥样硬化的发生发展危险性密切相关.ApoE4是早发性CHD发病的独立危险因素，Meta分析表明，ApoE4携带者比不带ApoE4者患CHD的危险性显著增加。&2等位基因的平均影响是降低胆固醇浓度，而且“降胆固醇作用”是&4的“升胆固醇作用”的2-3倍，表明&2有保护人群不患冠心病的倾向。在冠心病患者中，&4等位基因频率明显高于正常组，早发CHD患者（＜50岁）的&4等位基因频率比迟发者（＞50岁）更为增高。2、ApoE基因型与老年痴呆Coder等在1994年阐述了ApoE4的遗传剂量与FAD的关系，他们认为每多遗传一个ApoE4的等位基因，相应就增加了45%的AD的患病危险，也使得其发病年龄提前。在晚发型FAD中，每个ApoE4的等位基因能将发病年龄提前7-9年。他们的研究还表明ApoE2等位基因有降低AD发病风险以及延缓发病时间的作用。经众多研究者统计,AD患者中Apo