医学遗传学课件-临床遗传学

第十四章临床遗传学ClinicalGenetics第一节遗传病的诊断diagnosisofgeneticdiseases一般诊断（病史、症状、体征、实验室）特殊诊断（系谱分析、染色体检查、特殊生化检测、基因诊断）临症诊断、症状前诊断出生前诊断一、临症诊断(一)、病史、症状和体征1.病史：家族史、婚姻史、生育史2.症状和体征：特异性症候群PKU、半乳糖血症、性染色体病(二)系谱分析

pedigreeanalysis从先证者入手，调查其亲属的健康及生育状况，将调查材料绘制成系谱图进行系谱分析。由于各种单基因遗传病常表现出特定的孟德尔式遗传，所以，系谱分析常有助于单基因病的诊断。

1、系统性、完整性、可靠性

2、对于某些AD（延迟显性）≠隐性

3、新的基因突变

4、显、隐性的相对性

5、不规则显性；遗传异质性；限性/从性遗传与性连锁遗传/线粒体遗传病的区别等系谱分析注意事项系谱分析1系谱分析2pedigreeanalysis

3(三)细胞遗传学检查是较早应用于遗传病诊断的辅助手段，能较准确地判断和发现染色体数目和结构异常综合征，因而该方法是确诊染色体病的主要方法。

1．染色体检查

亦称核型分析（karyotypeanalysis）是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辩率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。染色体检查指证①MR、各种畸形;

②家族中有染色体异常及各种发育异常个体;

③男女不育症个体;④35周岁以上孕妇。2．性染色质检查主要针对性染色体数目异常疾病如：45，X3.染色体原位杂交应用标记的DNA片段与玻片上的细胞、染色体或间期核的DNA杂交，在样品核酸不改变其结构和分布格局的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系。

4.荧光原位杂交（FISH）应用荧光素标记的DNA探针与标本进行原位杂交后，使杂交区域发出荧光。优点：快速、安全灵敏度高特异性强。

图示为21三体综合征患者的FISH检测(四)生化检查

生化检查主要用于生化遗传病的检测。主要针对三方面：1）蛋白、酶活性；2）反应底物、代谢中间产物或终产物的浓度；3）受体的结合能力。例如疑为苯酮尿症患者，可检测血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸浓度；粘多糖病可测定尿中硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素等。(五)基因诊断（genediagnosis）利用分子生物学技术，在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。特点针对直接病因诊断特异性强，灵敏度高适应性强，诊断范围广目的基因是否处于活化状态均可，无组织和发育特异性在感染性疾病的基因诊断中，可检测正在生长的病原体或潜伏病原体基因诊断的样本可以是任何有核细胞，包括：1.外周血白细胞、口腔黏膜细胞;2.活检标本、石腊包埋的组织块;3.沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）;4.羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞;应用PCR，样本可微量化到一个细胞.基因诊断的基本技术核酸分子杂交聚合酶链反应PCRDNA测序技术DNA芯片1.限制性片段长度多态性（RFLP）分析RFLP：DNA顺序上发生变化而出现或丢失某一限制性内切酶位点，使酶切产生的片段长度和数量发生变化。RFLP分析：利用RFLP与DNASouthern印迹杂交结合对遗传病作出诊断和分析的方法。Southernblot印迹杂交通过用已知基因的DNA片段制备探针与待测基因组DNA的限制性酶切片段进行杂交，分析带谱。可直接确定致病基因的缺陷。是最经典、应用最广泛的分子遗传学技术。常用于基因缺失。镰状贫血的基因诊断IVS-I1.35kb1.15kb正常镰性镰状性状贫血MstII1.15kb1.15kb1.35kbIVS-IIβ珠蛋白基因

A→T点突变使原来MstII酶切位点消失2.聚合酶链反应

polymerasechainreaction,PCR模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；反应体系：DNA模板，TaqDNA聚合酶,引物，

dNTP，反应buffer反应程序：

变性

94~95℃20-30cycle

复性50~60℃延伸70~72℃

延伸72℃10minDNA扩增100万倍以上PCR扩增原理PCR特点及应用特点：（1）特异性强，灵敏度高，快速稳定；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物;应用：（1）基因组DNA分析；（2）基因表达的鉴定；（3）遗传病的诊断;缺点：（1）需靶DNA序列的信息；（2）DNA复制不精确;

（3）有时易出现假阳性PCR相关技术：

1.增效PCR（boosterPCR）

当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。2.巢式PCR（nestPCR）

也须进行二步PCR。不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物。此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。3、多重PCR多重PCR：在同一PCR体系中加入数对PCR引物，可同时扩增多个DNA片段。常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。4.RT-PCRRT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ng～ug水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。RT-PCR原理3.DNA测序

DNA测序（DNASequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。4.DNA芯片又称微阵（DNAarray）指把成千上万个寡核苷酸或cDNA探针密集、规律地排列在1cm2大小的硅片或玻璃芯片上，容量可达20～40万个基因探针。将荧光标记的DNA或cDNA样品送到在芯片上与探针杂交，经激光共聚焦显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号做出比较和检测，可迅速得出所需的信息，比常规方法快几十到几千倍。

DNAmicroarraysonglassslides表达谱芯片和寡核苷酸芯片芯片探针样本形式应用范围表达谱芯片长片段PCR产物mRNA或cDNA基因表达分析；新药开发，毒副作用分析寡核苷酸芯片短单链DNADNA片段遗传病检测；多态性位点检测；肿瘤诊断表达谱芯片工作原理提取RNA。Cy3标记对照组，Cy5标记实验组。混合两种探针，与芯片杂交扫描仪以两种波长激光扫描，532nm探测Cy3，633nm探测Cy5。Red：明显上调；green：明显下调，yellow：差异不显著。Cy5/Cy3的比率（0.5～2.0)。基因芯片应用基因芯片是生物芯片研究中，最先实现商品化的产品。

*寻找新基因

*DNA测序

*疾病诊断

*药物筛选

*毒理基因组学

*农作物优育和优选

*环境检测和防治

*食品卫生监督

*司法鉴定基因诊断是基因芯片中最具有商业化价值的应用从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。其他应用实例Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。二、症状前诊断针对一些发病较迟的常染色体显性遗传病患者在出现症状或生育前对其作出诊断。基因诊断是症状前诊断的主要手段。三、出生前诊断是对胚胎或胎儿是否患有遗传病或先天畸形在出生前进行的诊断。适应症选择原则①高风险、危害大②目前已有对该病进行产前诊断的手段（一）出生前诊断对象

根据母婴保健法第二十条规定，孕妇有下列情形之一的，医师应当对其进行产前诊断：

①羊水过多或者过少；

②胎儿发育异常或者胎儿有可疑畸形；

③孕早期接触过可能致畸物；

④有遗传病家族史或曾分娩过先天缺陷儿；

⑤初产妇年龄超过35周岁。（二）出生前诊断的方法与应用1.非侵袭方法①孕妇血清、尿液的生化检查②X线检查：18W以后，骨骼先天畸形③超声检查：几乎所有畸形的产前诊断④孕妇外周血胎儿细胞分离检测2.侵袭性方法根据妊娠时间及检测目的有针对性地选用不同的穿刺取样技术，然后将样品进行实验室检查（细胞遗传学、生化检查、基因诊断）（1）胎儿镜检查借助内窥镜在宫腔内直接观察胎儿情况。可以在怀孕18-20周进行，主要用于胎儿血取样、活检和产前诊断。穿刺最宜时间：孕16-20W，此期羊水量多，进针容易，不易伤及胎儿，另外此时羊水中有活力的细胞多，培养易于成活。

适应症：A高龄孕妇

B已生育过异常儿孕妇

C染色体平衡易位者

D有家族史者

禁忌症：A时间不符

B先兆流产/宫内感染

C适应症不明确

（2）羊膜穿刺（羊水取样）羊膜穿刺术新进展：着床前诊断在受精6天胚胎着床前进行优点：即可避免分娩患儿，又不必行流产术第二节遗传病的治疗TreatmentofGeneticDiseases遗传病治疗的现状：常染色体病：难性染色体病：激素替代，整形手术多基因病：药物治疗，手术治疗单基因病：药物治疗，饮食治疗，手术治疗，基因治疗一、常规治疗（手术治疗，药物治疗，饮食治疗）（一）手术治疗

A.整形唇裂、腭裂、并指(趾)、白内障、先天性幽门狭窄、外生殖器畸形等遗传病，可经手术矫正。一、常规治疗（手术治疗，药物治疗，饮食治疗）

D.移植是利用正常器官和组织替换病损的器官或组织。如多囊肾患者的肾切除和异体肾移植；镰形细胞贫血症的骨髓移植。C.切除家族性结肠息肉症的息肉切除；遗传性溶血和α-珠蛋白生成障碍性贫血的脾脏切除。

B.修补室间隔缺损、房间隔缺损等先天性心脏病都可采用手术修补59治疗原则：禁其所忌，去其所余，补其所缺

3.补偿先天性无丙种球蛋白血症患者，糖尿病患者，抗维生素D型佝偻病患者，垂体性侏儒患儿。

2.排毒

肝豆状核变性患者，可用药物（D-青霉胺)清除体内过剩的铜离子；丙磺舒等尿酸排泄剂治疗痛风。（二）药物及饮食治疗1.禁忌

苯丙酮尿症患者，限制苯丙氨酸的摄入；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)缺乏症患者，应严格禁食蚕豆和接触蚕豆花粉，严禁服用伯氨喹、阿司匹林等药物，便可避免溶血性贫血的发生；1、内科治疗：①给孕妇服药；②羊膜囊给药2、外科疗法：①宫内手术；②体外手术（三）出生前治疗二、基因治疗（genetherapy）概念：将外源性正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。美国医学家W·F·安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症AR

腺苷脱氨酶基因20q13

腺苷、dATP堆积，Tcells死亡严重的联合免疫缺陷症（SCID）患儿很少活到成年谢德尔，1999

1990年9月14日，安德森等对一例患ADA缺乏症的4岁女孩谢德尔进行基因治疗。经治疗后，免疫功能日趋健全，能够走出隔离帐，过上了正常人的生活。（一）基因治疗的原理与策略1、直接疗法：原位修复——基因修正

genecorrection

2、间接疗法：替代疗法——基因添加

geneaugmentation基因抑制/失活基因增强重新开放已关闭基因根据受体细胞不同，我们把基因治疗分为两种途径：A.生殖细胞基因治疗

显微注射发育

正常基因生殖细胞正常个体B.体细胞基因治疗

导入表达

正常基因体细胞基因产物

（二）基因治疗的方法与应用基因治疗得以实施必须具备的两个条件：

A.合适的基因转移手段

B.合适的受体细胞基因转移的方法物理法：注射、基因枪、电穿孔、显微注射化学法：磷酸钙、葡聚糖、脂质体生物法：病毒载体——逆转录病毒、腺病毒等

物理方法

661)裸DNA直接注射2)基因枪介导的皮内或皮下导入3)显微注射4)电穿孔cells

obtainedfromskinbiopsygene

introducedintocellsbyelectroporationgeneticallyengineeredcellsarepropagatedcellsarereinjected

Exvivoelectroporation化学方法1)磷酸钙共沉淀法2)DEAE-葡聚糖转染法3)脂质体转染法生物学方法69ViralvectorsRetroviruses(逆转录病毒）Adenoviruses（腺病毒）2.靶细胞70造血干细胞成纤维细胞肝细胞肌细胞淋巴细胞肿瘤细胞①易于培养和分离，便于回输体内；②具有增殖优势，分裂能力强，生命周期长；③易于受外源遗传物质转化；④目的基因表达最好在具有组织特异性的细胞。选择靶细胞原则目前，在遗传病基因治疗中应用最多的靶细胞是造血干细胞和成纤维细胞；在肿瘤治疗中最常采用的是肿瘤细胞本身，其次是淋巴细胞和造血干细胞。2.临床应用1．腺苷脱氨酶(ADA)缺乏症2．

1-抗胰蛋白酶缺乏症3．囊性纤维化病4．家族性高胆固醇血症5．珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病6．血友病和其他血浆蛋白缺乏症7．慢性肉芽肿可供基因治疗选择的遗传病：ADA缺乏症的基因治疗（腺苷脱氨酶）

治疗：T淋巴细胞为靶细胞，体外途径从ADA缺陷型患儿外周血中分离出单核细胞，细胞因子及抗体刺激T细胞增殖，以逆转录病毒载体转染靶细胞，使ADA基因稳定整合，扩增T细胞后回输。

病因：ADA基因ADA缺乏T淋巴细胞代谢障碍死亡联合性免疫缺陷症乙型血友病的基因治疗应用逆转录病毒载体转染血友病B患者的成纤维细胞，回植到患者皮下。使患者血浆中IX因子抗原活性升高1～2倍，并持续2年以上，鼻出血等症状有所好转，每年所需输血次数减少。但转入的IX因子表达水平仍有待进一步提高。病因：凝血因子IX基因功能异常IX因子减少临床：出血、凝血时间异常

治疗：靶细胞（皮肤成纤维细胞），体外途径恶性肿瘤的基因治疗

（1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；

肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。（2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；（3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；（4）通过导入“自杀基因”杀伤癌细胞。由5型腺病毒载体与人p53基因重组的肿瘤基因治疗药物。适应证：头颈部鳞癌其他：肺癌;乳腺癌;胃癌;子宫颈癌恶性肿瘤基因治疗举例（三）基因治疗中存在的问题1.稳定性2.安全性3.高表达4.免疫性5.伦理问题美国亚利桑那州18岁的高中毕业生泽西·杰辛格，鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症，1999年，宾夕法尼亚大学，基因治疗４天后，因发烧、凝血障碍而死亡。第三节遗传病的预防一、遗传筛查——群体遗传病普查（一）出生前筛查（二）新生儿筛查（三）携带者筛查携带者：指表型正常，但带有致病遗传物质的个体。一般包括：①隐性遗传病杂合子；②显性遗传病的顿挫型；③表型尚正常的延迟显性者；④限性遗传的不发病性别；⑤线粒体遗传病女性突变者；⑥染色体平衡易位者。（一）遗传咨询的对象和步骤

1、夫妇一方患某遗传病，需要给予生育指导；

2、夫妇生了一个遗传病患儿，询问再发风险；

3、不育及习惯性流产者；

4、婚前或婚后了解到亲属中有遗传病病人，担心子代也会患此遗传病；

5、近亲婚配；

6、家庭成员中得了病因不明的疑难杂症，要求肯定或排除遗传病的可能性。二、遗传咨询GeneticCounseling（1）认真填写病历（2）对患者进行必要的检查（3）对再发风险做出估计（4）与咨询人商讨对策（5）随访和扩大咨询遗传咨询的步骤（二）遗传病再发风险的估计

再发风险（RecurrenceRisk）是指曾生育过一个或几个遗传病患儿，再生育该病患儿的概率。再发危险率的估计是遗传咨询的核心内容，也是遗传咨询有别于一般医疗门诊的主要特点。

再发危险率：>10%为高发危险率──绝育

5%～10%为中度危险率──酌情处理

<5%为低发危险率

1.染色体病再发风险的估计

染色体病一般为散发性，其畸变主要发生在亲代生殖细胞的形成过程中，因此，再显危险率实际上就是群体发病率。

然而，也有一些例外，如双亲之一为平衡易位携带者或嵌合体，子代就有较高的再显危险率。2.单基因病的再发风险估计

（1）亲代基因型已推定时，子代患病风险按孟德尔定律估算AD：患者后代1/2发病风险AR：患者同胞1/4发病风险XD：男患后代：儿子正常/女儿患者女患后代：儿子女儿各1/2发病风险XR：男患后代：儿子正常/女儿携带者女携后代：儿子1/2发病、女儿1/2携带（2）亲代基因未能推定时，再发风险率的估计可利用家系资料中诸如正常孩子数和发病年龄等信息，根据Bayes定律来进行