第七章 质量控制

PAGEPAGE230第七章农药残留分析的质量控制农药残留分析属于痕量分析范畴，分析的农药及样品基质种类多，成份复杂，分析中投入的成本高。分析的结果经常用于政府管理部门作为贸易、生产等活动的决定性依据，具有极大的责任和权威性。如果没有严格、科学的质量保证和质量控制程序，难免出现分析结果不准确而造成决策失误和花费大量投入建设的残留分析实验室不能合格有效运行的浪费等现象。因此，做好残留分析的质量控制是产生准确、可靠的残留分析数据的重要前提和保证。农药残留分析质量控制的目的是使分析结果达到预定的准确和精密程度。为了达到这一预定目的所应采取的措施和工作步骤都是事先规划好的，通过一系列的规约加以确定，并要求有关分析人员按照规约操作，由此使分析过程处于受检状态。7.1农药残留分析实验室的基础条件实验室是获得残留分析结果的关键场所，要使残留分析质量达到规定水平，必须要有合格的实验室和合格的分析操作人员。包括仪器的正确使用和定期校正；玻璃仪器的选用和校正；化学试剂和溶剂的选用；溶液的配制和标定、试剂的提纯；实验室的清洁度和安全工作；分析人员的操作技术等。7.1.1试剂要求1.蒸馏水蒸馏水是残留分析实验室最常用的水之一，通过蒸馏可以大大减少水中所含有的农药或其它杂质，有效减少对残留分析的干扰。但是，蒸馏水中常含有可溶性气体和挥发性物质。残留分析实验室一般不用金属蒸馏器。也不采用离子交换法制备的去离子水，因为去离子水中仍然含有影响残留农药分析的杂质。最好采用石英玻璃蒸馏器蒸出的重蒸馏水。2.试剂一般化学试剂分为四级，其规格见表7-1。表7-1化学试剂的规格级别名称代号标志颜色特级基准试剂、光谱纯S•P白色一级保证试剂、优级纯G•R绿色二级分析试剂、分析纯A•R红色三级化学纯C•P蓝色残留分析中所用试剂均应为二级或二级以上，高效液相色谱仪流动相则应使用一级（或称色谱纯）。由于市售的试剂往往达不到残留分析的要求，需要进行净化处理。为了确定溶剂的纯度是否满足农药残留分析的要求，对市售的溶剂按下法检验：取300mL溶剂，放入旋转蒸发器中，浓缩至5mL。取5μL，在准备应用的色谱条件下，注入气相色谱仪内，在色谱图上于2~60min内，不应有1mm以上的杂质峰。某溶剂在整个分析方法过程中使用一定数量，取总量的2倍量，浓缩并定容到最小体积，取最大进样量进样，不出现杂质峰或产生小于噪音两倍或小于1～2mm的峰为标准。达到上述检验要求的溶剂，可以直接供农药残留分析使用。达不到要求的溶剂，根据溶剂的性质和所含的杂质，分别选择提纯方法。常用试剂的处理方法如下：⑴.氧化铝（层析用）：在550℃灼烧4小时。用前于130℃烘5小时，储存于干燥器内备用。⑵.弗罗里硅土（florisil）：在600~650℃灼烧3小时。用前于130℃烘5小时，储存于干燥器内备用。⑶.无水硫酸钠（分析纯，干燥脱水用）：在700℃灼烧4小时，用前于130℃烘5小时，储存于干燥器内备用。⑷.活性炭：分为两种，第一，层析用活性炭：20~40目；第二，化学纯级活性炭：黑色无定型颗粒物或粉末。处理方法：将活性炭放入浓盐酸中，加热煮沸1小时，用蒸馏水洗至中性，烘干后，放入带盖瓷皿内、盖上皿盖，在600℃灼烧2小时，用前在105℃烘4小时，储存于干燥器内备用。⑸.脱脂棉及玻璃棉：放入索氏提取器中，加4%丙酮-正己烷溶剂，在水浴上回流4小时后，在通风橱内让其自行挥发干。⑹.石油醚或正己烷：石油醚通常用沸程60~90℃。其主要成分是脂肪族烃类的混合物，杂质主要为芳香族不饱和化合物。提纯方法有：①.将石油醚通过中性的氧化铝柱吸附后，再经全玻璃系统蒸馏器蒸馏。收集其标程范围内的馏出部分（60～75℃）。②.取1000mL石油醚，加4gNaOH(A.R)，于水浴上回流2小时，再经全玻璃系统蒸馏器蒸馏。收集其标程范围内的馏出部分（60～75℃）。③.将1000mL石油醚置于分液漏斗中，加入100mL浓硫酸（石油醚与硫酸的比例为10:1）充分混匀后，让其分层，放去硫酸层。重复上述操作2~3次，然后用水洗，再用无水硫酸钠干燥，过滤后，经全玻璃系统蒸馏器蒸馏。收集其标程范围内的馏出部分（以下各种溶剂提纯中，所说的蒸馏，均指全玻璃系统蒸馏器蒸馏）。⑺.丙酮：一般，市售的丙酮均能达到要求。其中含有大量水分，通常不超过0.5%。如果含水量较大，直接通过3A或4A分子筛层析柱脱水后，即可使用。如果丙酮中含有醛类和其他杂质时，可向丙酮中逐次加入少量高锰酸钾进行回流，直至紫色不褪为止。然后蒸馏，收集沸程为55~57℃的馏分，置于棕色瓶中保存。⑻.醋酸乙酯：醋酸乙酯中通常含有少量的游离酸（醋酸）、乙醇和水等杂质。提纯时，将醋酸乙酯置于分液漏斗中，用同等体积的5%Na2CO3水溶液充分洗涤后，弃去水层。然后，无水碳酸钾进行干燥，过滤后，蒸馏。收集沸程为76.5~77.5℃的馏分。或1000mL乙酸乙酯，加入100mL乙酸酐和10滴浓硫酸，加热回流4小时，蒸出后，再用碳酸钾干燥，过滤，再蒸馏，收集沸程为76.5~77.5℃的馏分。⑼.乙腈：该溶剂由于毒性非常大，使用时应特别注意。在国内残留分析方法中使用较少，国外使用较多。乙腈是一种非常惰性的试剂，可与水、醇和醚任意混合。其提纯方法如下：①.向乙腈中加入数克无水碳酸钠，至不溶为止。再加入少量高锰酸钾，加热回流至紫色不褪为止。然后进行蒸馏。蒸馏液用硫酸调至微酸性后，再进行精馏，收集81~82℃的馏分。②.取1L乙腈，加入1mL磷酸，再加入30g五氧化二磷，加沸石进行蒸馏。收集81~82℃的馏分（不超过82℃）。③.如果乙腈中所含杂质较少，可直接通过硅胶或分子筛层析柱脱水后，蒸馏。收集81~82℃的馏分。⑽.三氯甲烷：三氯甲烷遇阳光照射后在空气中氧的作用下，逐渐分解，生成极毒的光气（碳酰氯）。为了防止生成光气，一般市售的三氯甲烷加有0.5～1%的乙醇作为稳定剂。如果乙醇不影响分析，可直接重蒸馏。收集沸点61.2℃的馏分。置于棕色试剂瓶中避光保存。如果需要除去乙醇，可按下法处理：取500mL三氯甲烷于1000mL分液漏斗中，加入25mL浓硫酸，振摇数分钟，静置分层后，弃去酸层，重复上述操作2~3次。然后用100mL2%的硫酸钠溶液洗两次，再经无水硫酸钠干燥，蒸馏，收集沸点61.2℃的馏分。置于棕色试剂瓶中避光保存。⑾.二氯甲烷：是常用溶剂，特别在液——液分配净化中。一般二氯甲烷可直接重蒸馏后使用。如果需要进一步提纯，可按三氯甲烷的提纯方法进行处理。收集沸程39~41℃的馏分。置于棕色试剂瓶中避光保存。⑿.甲醇：一般甲醇进行重蒸馏，收集65±1℃的馏分，即可使用。如果需要除去甲醇中的微量丙酮，可于500mL甲醇中加入25mL呋喃甲醛和60mL10%NaOH溶液，加热回流8小时后，蒸馏。收集65±1℃的馏分。再加入无水氯化钙进行脱水，过滤。最后采用高效分馏柱进行重蒸馏，收集65℃的馏分。7.1.2实验室的环境条件实验室空气中如含有固体、液体的气溶胶和污染气体，对痕量分析和超痕量分析会导致较大误差。实验室应按照样品存贮、天平称量、样品制备、仪器分析等划分功能区。农药残留分析中常用的高灵敏度仪器（GC，HPLC等），应在洁净的、单独的实验室中使用，不能和样品制备实验室混在一起。样品制备操作应在专门的通风橱内进行，几种分析同时进行时应注意防止相互交叉污染。实验室内需设各种必备的安全设施（通风橱、防尘罩、排气管道及消防灭火器材等），并应定期检查，保证随时可供使用。使用电、气、水、火时，应按有关使用规则进行操作，保证安全。7.1.3人员要求1.残留分析人员应具有大专以上的文化水平，经培训、考试合格后才能承担残留分析工作。2.熟练地掌握本岗位的残留分析技术，对承担的残留分析项目要做到理解原理、操作正确、严守规程、准确无误。3.接受新项目前，应在测试工作中达到规定的各种质量控制实验要求，才能进行项目的残留分析。4.认真做好分析测试前的各项技术准备工作，实验用水、试剂、标准溶液、器皿、仪器等均应符合要求，方能进行分析测试。5.负责填报残留分析结果，做到书写清晰、记录完整、校对严格、实事求是。6.及时地完成分析测试后的实验室清理工作，做到现场环境整洁，工作交接清楚，做好安全检查。另外，农药残留分析实验室内要有质量保证专职或兼职人员，负责残留分析的质量保证工作。残留分析质量保证人员应熟悉质量保证的内容、程序和方法，了解残留分析环节中的技术关键，具有有关的数理统计知识等。7.1.4管理制度1.样品管理由于残留分析样品的特殊性，要求样品的采集、运送和保存等各环节都必须严格遵守有关规定，以保证其真实性和代表性。残留分析实验室的技术负责人应和采样人员、测试人员共同议定详细的工作计划，周密地安排采样和实验室测试间的衔接、协调，以保证自采样开始至结果报告的全过程中，样品都具有合格的代表性。样品的登记、验收和保存要按以下规定执行：⑴.采好的样品应及时贴好样品标签，填写采样记录。将样品连同样品登记表、送样单在规定的时间内送交指定的实验室。填写样品标签和采样记录需使用防水墨汁，最好用铅笔填写。⑵.如需对采集的样品进行分装，分样的容器应和样品容器材质相同，并填写同样的样品标签，注明“分样”字样，同时对“空白”和“副样”也都要分别注明。⑶.实验室应有专人负责样品的登记、验收，其内容如下：样品名称和编号；样品采集点的详细地址和现场特征；样品的采集方式，是单独样品还是混合样；采样日期和时间；采样人、送样人及登记验收人签名。2.药品管理⑴.实验室使用的化学试剂应有专人负责管理，分类存放，定期检查使用和管理情况。⑵.易燃、易爆物品应存放在阴凉通风的地方，并有相应安全保障措施。易燃、易爆试剂要随用随领，不得在实验室内大量积存。保存在实验室内的少量易燃品和危险品应严格控制、加强管理。⑶.剧毒试剂应有专人负责管理，加双锁存放，批准使用，两人共同称量，登记用量。⑷.取用化学试剂的器皿（如药匙、量杯等）必须分开，每种试剂用一件器皿，至少洗净后再用，不得混用。⑸.使用有机溶剂和挥发性强的试剂，操作应在通风良好的地方或在通风橱内进行。任何情况下，都不允许用明火直接加热有机溶剂。3.仪器管理⑴.各种精密贵重仪器以及贵重器皿要有专人管理，分别登记造册、建卡立档。仪器档案应包括仪器说明书、验收和调试记录、仪器的各种初始参数，定期保养维修、检定、校准以及使用情况的登记记录等。⑵.精密仪器的安装、调试、使用和保养维修均应严格遵照仪器说明书的要求。上机人员应该考核。考核合格方可上机操作。⑶.使用仪器前应先检查仪器是否正常。仪器发生故障时，应立即查清原因，排除故障后方可继续使用，严禁仪器带病运转。⑷.仪器用完之后，应将各部件恢复到所要求的位置，及时做好清理工作，盖好防尘罩。⑸.仪器的附属设备应妥善安放，并经常进行安全检查。应保存每一台仪器设备的档案，其内容包括：①.仪器设备名称；②.制造商名称、型号。序号或其他唯一性标识；③.接收日期和启用日期；④.目前放置地点（如果适用）；⑤.接收时的状态及验收记录（例如全新的，用过的，经改装的）；⑥.仪器设备使用说明书（或复制件）；⑦.校准和／或检定（验证）的日期和结果以及下次校准和／或检定(验证)的日期；⑧.迄今所进行维护的记录和今后维护的计划；⑨.损坏、故障、改装或修理的历史记录。7.2农药标准物质农药残留量的检测，绝大多数是采用大型精密仪器实现的。这些定量方法通常为比较法，即用农药标准物质校准分析仪器，以其峰面积或峰高值为基准，在获得未知样品峰面积或峰高值后，就可计算出未知样品中某种农药的残留量。因此，农药标准物质是开展农药残留分析工作的先决条件，也是测定结果准确与否的质量保证。农药标准物质既然是一个基准尺度，分析工作者对它的要求就非常严格。如果它不符合要求，就会在分析检测过程中将不准确的信息传递到被测定的样品中去。本来农药残留量不超标的样品，由于农药标准物质标定值偏低，最后的检验结果可能是不合格，反之亦然。所以从这一点讲农药标准物质不在于纯度有多么高，而在于它的标定值必须准确无误。由于农药残留分析为痕量分析，对不确定度的要求相对不高，因此用于农药残留分析的标准物质不象农药制剂分析标准物质那样苛刻，但也必须定值准确，无干扰组分。农药标准物质在农药残留分析中的主要作用是测定方法的建立或验证已有方法的不确定度和精密度。另外，对于中介的授权质检机构必须采用有证农药标准物质，才能开展农药残留的检验工作，对农产品中的农药残留指标进行判定。农药标准物质是实现农药残留准确一致的测定、保证量值传递的计量标准。采用标准物质开展检验工作还可以保证测定结果的可比性，达到量值的统一。7.2.1概述1.定义和等级美国于1906年就对标准物质开展了研究和应用，先后采用StandardSample,StandardMaterial和StandardReferenceMaterial(SRM)三个名称。我国农药分析工作者也习惯将农药标准物质称为农药标样或农药标准品。但是“标样”和“标准品”已经不符合国际和国内的有关法规规定的叫法，因此有必要加以更正、正确的理解和使用。国际标准化组织（ISO）、国际法制计量组织（OIML）、国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）和世界卫生组织（WHO）等国际组织经过反复协商，1981年正式确定了国际公认的名称：标准物质和有证标准物质。我国目前在有关法规中也明确采用这一名称。标准物质（ReferenceMaterial,RM）：具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。有证标准物质(CertifiedReferenceMaterial,CRM)：附有证书的标准物质。其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的用于表示该特性值的计量单位，而且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。有证标准物质一般成批制备，其特性值是通过对整批物质的样品进行测量而确定，并具有规定的不确定度。标准物质一般分为两级：一级标准物质（PrimaryReferenceMaterial,PRM）：采用绝对测量方法或其他准确、可靠的方法测量标准物质的特性量值，其测量准确度达到国内最高水平的有证标准物质。该标准物质由国务院计量行政部门批准、颁布并授权生产。一级标准物质的均匀性、稳定性良好。它在溯源链中起着承上启下的作用。许多二级标准物质是通过一级标准物质溯源至国家基准的。一级标准物质的稳定性在1年以上或达到国际上同类标准物质的先进水平。在包装形式上应符合一级标准物质技术规范的要求。生产一级标准物质，国家有关业务主管部门有一套程序和管理办法。在只有一种定值方法的情况下，一级标准物质定值过去还采用多个实验室以同种准确可靠的方法定值。目前，国际公认的化学测量权威方法有精密库仑法、同位素稀释质谱法，重量法、容量法、凝固点下降法等。一级标准物质通常用于描述该种农药的理化常数。即使制备少量的一级标准物质，也要耗费大量的人力和宝贵材料，致使一级标准物质价格昂贵，一般不用于日常农药残留测定工作。二级标准物质（SecondaryRM或WorkingStandard）是指用与一级标准物质进行比较测量的方法或一级标准物质的定值方法定值，其稳定度和均匀性未达到一级标准物质水平，但能满足一般测量的需要。二级标准物质是在日常分析检测中大量采用的一类标准物质。二级标准物质通常是国际农药分析协作委员会（CIPAC）定义的工作标样，许多工作标样，可以直接应用原药或稍加纯化。不论是一级标准物质还是二级标准物质均为有证标准物质。农药纯品（PurePesticide）是指目前对农药提纯和鉴定技术最高水平所能达到的条件下，纯化出的能够真正反映农药化合物本身特性的高纯度物质。农药纯品不同于农药标准物质，而是农药标准物质的原材料。它仅有科技含量，没有业务主管部门的授权和认可。农药纯品除不具有量值传递、质量检验功能以外，其他的功能还是具备的，如用于教学和科学研究工作等。农药纯品若要成为农药标准物质必须按照国家有关业务主管部门的一套程序和管理办法进行制备、鉴定、定级和定值。在国际农药分析协作委员会手册（CIPACHANDBOOKVol.IA-J）中有农药纯品制备一章，现已发表了2,4-D、2甲4氯、2,4,5-涕、敌敌畏、狄氏剂、二硝甲酚、艾氏剂、鱼藤酮、地乐酚、草芽平、2甲4氯丁酸、2甲4氯丙酸、杀螨酯、除螨酯、敌草快二溴盐一水合物、百草枯二氯化物、乐果、赛草清、2,4-滴丁酸、2,4-滴丙酸、溴苯腈、溴苯腈辛酸酯、毒虫畏、2,4,5-滴丙酸、消螨通、新燕灵、氰草津、抗蚜威、甲基嘧啶磷、嘧啶磷、乙嘧酚、乙嘧酚磺酸酯的制备和定值方法。2.基本要求⑴.含量纯度一般应达到99%以上。一级标准物质应定值到小数点后两位。工作标样为小数点后一位。工作标样的纯度可以低于99%，但定值要准确可靠，无干扰物质。在均匀性方面还必须按照均匀性检验程序分析并检测合格。⑵.物理常数象熔点、折光率等一类的物理常数应符合权威文献报导。⑶.溶液用相应溶剂溶解时，溶液应该是澄清的。⑷.薄层层析鉴定用合适的吸附剂，两种展开条件，显色后均为单点。⑸.经过气相色谱或液相色谱鉴定。用两种不同极性色谱柱或两种不同的流动相测定，扣除溶剂峰，面积归一化后杂质的含量应低于1%。⑹.红外光谱鉴定与权威的标准图谱比较完全一致。⑺.质谱鉴定不论是气质联用还是液质联用，应该与标准谱库中相对应的农药质谱图有较高的相似度或通过对裂解的离子碎片进行解析，裂解机理合理。3.来源与合法性制备和定值农药纯品是一项耗时多、技术要求高的工作，只能由具有良好装备、丰富经验的专业人员并且得到有关方面认可的实验室来承担。我国的农药标准物质研究工作还满足不了市场和实际工作的需求。目前的现状，通常是由负责起草农药制剂标准的单位来提供农药纯品，至于通过什么手段和程序来纯化和定值，则没有统一规定。因此，有必要确定农药标准物质的纯化和定值方法，提高分析结果准确性和可比性。在我国能够提供农药标准物质或纯品的单位主要有国家标准物质研究中心、农业部农药检定所、沈阳化工研究院。另外一部分由农药研究机构、大学、农药公司、化学试剂公司提供。国外能够提供农药纯品的主要是化学试剂公司如Sigma公司等。Chemservice公司()是专门经营纯品的一家机构，该公司经销800多种农药纯品和代谢物以及用于各种标准分析方法（EPA）的混合溶液。外国农药公司在中国境内农药注册登记，农药残留试验所用的纯品通常由各公司提供。由国际权威部门或国家标准物质研究中心提供的有证农药标准物质是开展农药残留分析的基础。即使在没有合法的农药标准物质时，质检机构也要通过必要的程序保证检验工作的合法性。凡来自非授权机构生产经销的农药纯品，只能用于自己的教学、科学研究、方法的建立等，而不能用于开展执法性质的农残检测工作和在产品农药残留检验项目的仲裁工作。4.标签标签是农药一级标准物质、二级标准物质乃至农药纯品的合格证书，图7-1为一张二级标准物质的合格证书样例。有证农药标准物质的标签格式和内容应符合国家有关规定和要求。5.包装和贮藏大批量的农药标准物质和纯品应该及时分装，分装后可避免二次污染。液体的样品可以采用安培瓶分装。固体农药包装最好采用小体积的带有合适内盖（通常有锡箔纸或聚四氟乙烯内衬）和螺纹外帽，开启后能重新盖好的小玻璃瓶。玻璃瓶的容量一般为1mL、2mL、5mL和10mL。由于有些农药遇光分解，因此还应有棕色玻璃瓶或用避光纸包装。农药标准物质或纯品在贮存和运输过程中应避免光照或包装不严与空气接触。一般贮于干燥器（最好充氮气）内，然后置于冰箱中（-18℃）。有些农药纯品极易分解，有效期很短，如有机磷农药敌敌畏、氧乐果等，这类农药往往是现制备现用。对于稳定性好的农药即使过了有效期，重新定值后还不失去使用价值。而且这种定值通常只需要检测有效成份含量。应该说明的是大多数农药在经过高度纯化后，会比在原药及制剂形式下更为稳定。新农药的纯品稳定性通常要经过2年时间的考察。农药二级标准物质合格证书中文通用名称：__________________英文通用名称：_____________________化学名称（IUPAC）：CAS：______________结构式：分子式：______________分子量：__________________批号：样号：_______________质量：_________________(mg)纯度：______________________%（m/m）；________________________g/kg纯化和定值方法（必要时附图）：____________________________________用途：____________________注意事项：_____________________________贮藏：____________________有效日期：_____________________________研制生产单位（章）_______________________________________________鉴定人（签名）：__________________，_____________________生产日期：________年_____月______日图7-1农药二级标准物质的合格证书样例7.2.2农药纯品常用的制备方法农药纯品的制备实际是对有机化合物的分离和纯化的过程。如果需要制备的是一级标准物质则必须采用一种或多种制备方法进行高度纯化。如果制备工作标样，则可根据用途和分析测定方法来决定纯化的步骤和程度。农药纯品的制备需要原料（起始物质）。原料可以是工业原药（原粉或原油），纯度至少90%以上。同时要对原药进行挑选，如色泽、不同部位等。在实验室内进行合成，也是获得高纯度原料的一种方法。这种合成需要使用纯化后的试剂及中间体，其原料纯度应达99%以上。易光解、热解或稳定性差的农药更适合于实验室内合成。下列纯化技术方法可以单独或联合采用。1.重结晶法对于含少量杂质的农药原粉，最有效的纯化方法是选用适宜的溶剂进行重结晶，以分离除去杂质。⑴.重结晶原理农药原药在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高，溶解度增大。如果把原药溶解在热的溶剂中并达到饱和，那么冷却时，由于溶解度降低，结晶析出。利用溶剂对样品和杂质的溶解度不同（样品溶解度在室温时比杂质的溶解度小），使样品从过饱和溶液中以结晶析出，而杂质则留在溶液里，从而达到了分离的目的。⑵.重结晶溶剂的选择采用重结晶提纯农药能否成功，关键是选择合适的重结晶溶剂。常用的重结晶溶剂见表7-2。表7-2常用的重结晶溶剂溶剂沸点（℃）冰点（℃）相对密度与水的混溶性易燃性水甲醇95%乙醇冰乙酸丙酮乙醚石油醚氯仿乙酸乙酯苯四氯化碳100.065.078.1117.956.234.530~6061.70＜0＜016.7＜0＜0＜0＜0＜05＜01.00.79140.8041.050.790.710.641.480.900.881.59√√√√√×××××××√√√×√√√√√√√√√√√×√√√√√√×注：×—表示不溶解，√—表示溶解的程度⑶.选用重结晶溶剂的原则①.不与被纯化的农药发生化学反应。②.高温时能溶解较多农药，低温时只能溶解少量的农药。③.对杂质溶解度非常大（留在母液中），或溶解度非常小（以固态存在，过滤掉）。④.本身容易挥发易与结晶分离除去。⑤.如果该溶剂符合上述条件，取决析出的晶型如何。在提纯农药的过程中，如果不能选择到一种合适的溶剂时，常可使用混合溶剂获得满意效果。具体操作是：先将待纯化的农药在接近溶剂（溶解度大）的沸点时溶解，若有不溶物，趁热过滤，若有颜色，则用活性炭煮沸脱色后再趁热过滤。然后在此热滤液中小心地加入热的不良溶剂（溶解度小），直至所呈现的浑浊不再消失，再加入少量良溶剂或稍加热使之恰好澄清。最后，冷至室温，析出结晶。有时也将两种溶剂预先混合好。常用的混合溶剂如下：乙醇—水，乙醚—甲醇，醋酸—水，乙醚—丙酮，丙酮—水，乙醚—石油醚，吡啶—水，苯—石油醚。⑷.重结晶操作步骤选择重结晶溶剂→加热溶解→趁热过滤→结晶析出→减压抽滤→干燥①.加热溶解回流根据溶解度，称取适量的农药，加入回流瓶体积2/3的溶剂，脱色制备高温饱和溶液。回流时间一般30min。活性炭加法有两种：一是回流时加入到溶剂和农药样品一起回流；二是，待溶剂冷却至沸点以下时加入搅拌。活性炭加入量为1%~5%，太多对农药有吸附。必要时可两次脱色。注意事项：防止溶剂着火和活性炭引起爆沸。②.趁热过滤整个过程要迅速，防止结晶析出时操作无法进行，可采用保温漏斗，往往也采用减压抽滤，过滤后的溶液应是澄清的。减压抽滤要防止活性炭被抽入到滤液中。过滤可以使活性炭、不溶物（化学杂质、机械杂质）与高温的饱和溶液分离。③.结晶将滤液静置，使其慢慢冷却。慢慢得到的晶体颗粒大而均匀，纯度好，迅速冷却并搅拌得到的晶体颗粒细而不均匀，纯度差。对不易析出结晶的过饱和溶液，可采用玻璃棒摩擦容器内壁或投入“晶种”的方法。通过结晶可得到农药纯品和初纯品。④.抽滤通常减压抽滤，使用玻璃砂芯漏斗。洗涤晶体时，最好用重结晶溶剂（最好低温贮藏），洗涤时应先停止抽气，再加洗涤溶剂，用玻璃棒小心搅拌，使所有晶体湿润，静置片刻，再抽气。如果用沸点高的重结晶溶剂，改用低沸点溶剂冲洗，低沸点的溶剂必须与高沸点溶剂互溶，且对纯化的农药溶解度低。抽滤的目的是结晶与溶液分离。⑤.干燥将晶体转移到表面皿或合适的容器上。干燥可分为3种方法，自然干燥：放在实验台面上，让溶剂自然挥发。但对在空气中吸湿的样品不能采取这种方法。烘干：对热稳定性好的农药，可在低于其熔点的温度下于烘箱中或红外线灯下烘干。真空干燥器中干燥，可加热，可减压，干燥彻底。干燥的目的是排除残存的重结晶溶剂或某些挥发性杂质。干燥后的样品通常要研磨，贮存在合适的容器里或分装。然后放置在避光低温干燥场所。重结晶法适用于下列常用农药的纯化：乐果、亚胺硫磷、甲基对硫磷、敌百虫、克百威、甲霜灵、百菌清、2甲4氯、甲草胺、氟乐灵、溴氰菊酯、抗蚜威等。2.蒸馏法⑴.原理将液体农药加热至沸腾，使液态变为气态，然后再使蒸汽冷却凝结为液体进到另一容器中去，这样两个过程联合操作称为蒸馏。纯的液体农药在一定压力下有固定的沸点。如果在蒸馏过程中，沸点发生变动，就说明有杂质流出。为了得到纯的农药，就必须进行馏分截割。必须指出，具有固定沸点的液体不一定都是纯的物质，因为某些有机物常常和其它组分形成二元或三元共沸混合物，它们也有固定的沸点。大多数二元或三元共沸混合物，通常其共沸点要比任一单一组分的沸点都低。也有例外，如20%丙酮（56.2℃）和80%氯仿（61.2℃）混合，其混合液的沸点变成了64.7℃。液体的沸点随压力的不同而变化，所以分为常压蒸馏和减压蒸馏两种，农药纯品的制备采用减压蒸馏（图7-2）。图7-2农药纯品制备的减压蒸馏装置⑵.操作步骤和注意事项减压蒸馏装置主要由三部分组成,蒸馏、抽气以及在它们之间的保护和测压装置。蒸馏部分由蒸馏瓶、冷凝器和接收瓶组成。蒸馏瓶采用两个颈的克氏蒸馏瓶，一个颈插温度计，另一个颈插一根毛细管，起到沸石防止暴沸的作用。其他为普通冷凝器和接收瓶。减压装置主要由真空泵、真空胶管、保护和测压装置组成。在保护系统中，要有安全瓶，主要用于调节系统压力及放气。封闭式压力计用于测量系统中的实际压力。三个吸收塔，第一个装无水氯化钙或硅胶用于吸水；第二个装粒状氢氧化钠，用于吸酸；第三个装石蜡片，可吸收烃类气体。普通旋片式真空泵达不到工作压力时，还应串联真空扩散泵。减压蒸馏时，必须保证系统不漏气，各接口要涂好真空脂，不要用普通胶管代替真空胶管。具体步骤：①.加料液体量不要超过克氏蒸馏瓶容积的一半，可防止暴沸或液体的飞沫被蒸汽带走。蒸馏瓶要有2/3浸入到浴液中。②.减压检漏，调压调整到需要的压力，如敌敌畏，0.1Pa。减压蒸馏，采用磁力加热搅拌器是一种非常简便，高效的方法。③.加热100℃以下样品采用水浴，100~250℃油浴（甘油等），250℃以上砂浴。超过250℃时，不能采用玻璃蒸馏器。④.沸腾此时，温度计指示急剧上升。⑤.蒸馏开始时既不要快也不能太慢，控制速度为每秒钟1~2滴。接前馏分，注意观察压力和温度的变化，当达到所需馏分沸点时，更换馏分瓶；当温度超过所需馏分沸点时，停止蒸馏。减压蒸馏法对在常压下蒸馏易分解或遇热易分解的样品非常有效。一般要进行2~3次重蒸馏，才能达到要求。注意事项：温度计水银球的上限与蒸馏瓶支管下限在一水平面上，先搅拌、减压、后升温。减压蒸馏法适用的农药品种：2,4-D丁酯、敌敌畏、稻瘟净、禾草丹等，3.柱层析法柱层析法的特点是应用范围广（固体、液体都适宜），操作简便，分离效率高。⑴.基本原理：根据组分在固定相中的作用原理不同，柱层析可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析和排阻层析。农药纯化常用吸附层析和分配层析。吸附层析是根据固定相（吸附剂）对混合物中各组分的吸附能力不同来完成分离和纯化的目的。比如我国用硅胶作固定相，当混合物的溶液流经固定相时，混合物中各组分就被吸附在硅胶颗粒表面上。再用单一溶剂或混合溶剂作流动相通过该柱，由于硅胶对混合物中各组分的吸附性能不同，已被吸附在氧化铝上的各组分就会以不同的速度解吸并重新回到溶剂中。随着溶剂的向前移动，已解吸的各组份遇到新的吸附剂就又再一次以不等的吸附力被吸附，当新的流动相流过时，它们就又一次解吸进入流动相并向前移动。如此在层析柱上不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸，使混合物中各组分在吸附剂表面上表现出的吸附能力的微小差异经多次重复积累而成为大的差异。结果吸附力小的组分先从柱中流出，吸附力大的组分后从柱中流出，从而达到分离的目的。分配层析与吸附层析的不同之处是混合物中各组分的分离是根据其在两种不相溶或微溶的液体间溶解度的差异来实现的。吸附层析实质属于液—固色谱范畴，而分配层析属于液—液色谱范畴。⑵.操作的基本步骤①.选择层析柱（长度和口径之比10:1为宜），碱式滴定管可当层析柱来使用。②.选择吸附剂要求：a.不溶于使用的洗脱剂；b.不与洗脱剂和分离组分起化学反应，也不起催化作用；c.无色，粒度均匀，细度合适。常用有硅胶、氧化铝、弗罗里硅土等。一般分离极性大的物质，选用吸附力小的吸附剂；分离极性小的物质，应选用吸附力强的吸附剂。③.填装吸附剂要求均匀紧密一致干法和湿法两种：干法不容易填装均匀，湿法容易装好层析柱，湿法是称取适量的吸附剂，一般为分离样品重量的50倍加入溶剂调和，调好后倒入柱中，使其慢慢沉降。④.选择洗脱剂，可采用薄层色谱的方法选出理想的洗脱剂。选择原则如下：a.分离极性大的农药，选用吸附能力较弱的吸附剂和极性较强的溶剂作洗脱剂。b.分离极性小的农药，宜选用吸附能力较强的吸附剂和极性较小的溶剂作洗脱剂。c.在单一溶剂作为洗脱剂不理想时，可加入一些极性更大或更小的溶剂来调节洗脱剂的极性，以达到最佳分离效果。⑤.洗柱除去柱中的残留空气，使柱更紧密均匀，保持柱顶不干。⑥.加样待洗柱时的洗脱剂离柱填料平面1mm左右，加入待分离的组分。滴加洗脱剂，流速1滴/s，或1滴/4s。在操作过程中，防止柱顶端进入空气，不要让柱填料裸露在空气中。⑦洗脱根据分离情况，切割收集各组分，进行鉴定，找到纯度高的馏分，然后蒸馏干燥得到农药纯品。柱层析适用于下列农药品种的纯化：如杀草丹、丁草胺、2,4-D丁酯等。4.区熔提纯法（区域熔融法）根据被提纯农药中各组分在相变化中的重分布的原理，从而得到较纯组分的提纯方法。杂质一般使纯物质的熔点降低，随着熔区的移动，能使杂质一起移动，而富集于一端，纯物质则向相反的方向移动而富集于另一端。该方法设备简单，提纯效率高，操作可自动化，应用范围广。一般操作先卧式提六次，再立式提一次。本方法适用于六六六4种异构体等农药的提纯。5.升华法所谓升华就是指物质不经过液态而直接从固态转变为气态的现象，这样的农药必须具有相当高的蒸汽压。升华法有常压和减压两种方法。可以升华的农药品种有：硫磺、六六六、西力生、磷化铝等。升华法在农药纯品制备中应用较少。6.色谱法常用的薄层色谱也可以制备农药纯品，但获得量仅为毫克级。利用制备色谱仪或半制备色谱仪纯化农药，可获得克级水平纯品。该方法要求有大型设备，适于工业化、商品化生产。目前液相制备色谱仪应用较多，缺点是分离后往往需要重新蒸馏。7.2.3农药纯品常用的鉴定方法对于提纯的农药纯品样品，还要经过定性鉴定和定量分析，综合考虑各种因素对测量结果的影响，确定该种农药纯品的纯度后才能应用，若想成为农药标准物质还必须符合有关程序要求，获得授权，合法生产。农药纯品的定性通常要采用三种不同的方法进行检验，方法中至少应包括一种物理化学方法和一种色谱方法。定性检验的目的是明确农药在提纯过程中是否发生了化学变化，或者纯度能否达到一级标准物质的要求。定性检验应先于定量检验。清楚定性检验结果后，才能决定是否对被提纯农药进行准确定值。农药纯品的定值至关重要，对于一级标准物质必须采用绝对测量方法，二级标准物质可用一级标准物质直接对比测量。农药纯品的定值通常要采用二种不同原理的方法定值。常用的农药纯品定性方法有：1.物理常数的测定采用的测定方法应该是经典的或国际、国家标准中承认的有效方法，不采用上述方法，所测数据则没有可靠性、可比性。⑴.熔点测定对固体农药纯品定性鉴定测定熔点是一种方便和可靠的方法。每种农药纯品都有其固定的熔点（见表7-3）。对于纯化好的农药，其熔程越窄说明纯度越高，质量越好。熔点100℃以下的农药通常熔程应小于0.5℃。表7-310种农药纯品的熔点农药名称熔点（℃）农药名称熔点（℃）丙体六六六乐果除草醚亚胺硫磷甲基对硫磷111.8~112.851~5270~7172.0~72.735~36莠去津甲草胺稻瘟灵苄嘧磺隆百菌清173~17539.5~41.550~51185~188250~251⑵.沸点的测定对液体农药可以通过测定其沸点定性。常压测定时农药通常会分解。几乎所有农药的沸点都是在减压的情况下测定，因此实际测定不方便，常见农药的沸点见表7-4。表7-410种农药纯品的沸点农药名称沸点农药名称沸点敌敌畏2,4-D丁酯禾草丹禾草特百菌清70℃/133Pa169℃/267Pa126~129℃/1.07Pa202℃/1333Pa350℃/101325Pa丁草胺杀虫脒三氯杀螨醇异丙甲草胺倍硫磷156℃/66Pa163~165℃/18Pa100℃/13Pa100℃/0.1Pa87℃/1.33Pa沸程同农药的纯度也有密切关系，一般沸程应该在0.5~1℃。⑶.溶解度的测定各种农药纯品在不同溶剂中的溶解度可从文献中查出。溶解后的溶液应该完全澄清。⑷.其它物理常数的测定农药纯品的相对密度、折光系数、蒸汽压等也是同样重要的检验项目，所测值应与文献记载数据完全一致。2.光谱法定性⑴.紫外光谱法利用农药分子吸收紫外光的特性，对农药纯品进行定性或结构分析的方法。虽然紫外光谱图提供的信息较简单，但是也能够反映出农药分子中是否存在双键、芳烃、共轭体系，其中吸收曲线、最大吸收峰、摩尔吸光系数都是很重要的定性指标。农药紫外光谱图库较少，多散见在各种文献中。所用的测定方法、溶剂对紫外吸收曲线有很大影响，产生蓝移或红移。⑵.红外光谱法利用农药分子对红外光吸收的特性，分析农药分子结构的一种方法。能够快速测定农药分子的骨架和官能团。有标准的红外光谱图库供检索，提纯后的农药红外光谱图应与标准谱图一致。无杂峰出现。⑶.核磁共振波谱法通过测定原子核在磁场中及电磁波照射下的共振信号，作出核磁共振图谱，用以分析鉴定农药分子的组成和结构的方法。通常能精确地测定农药分子的微细结构。特别适合于光学异构体结构鉴定。3.色谱法定性色谱法定性的依据是Rf值、相对保留时间、相对保留指数。要求农药纯品与农药标准物质的相对保留值应一致或在允许范围内。色谱法的另一优点还可以筛分农药纯品中的杂质。⑴.薄层色谱法该方法为经典的方法，文献量较大，易于查找和应用。通常选用合适的吸附剂和显色条件后，采用二种展开剂展开，应显现出单一斑点，原点无残存物。在条件一致的情况下，农药的Rf值是定性的重要依据。⑵.气相色谱方法气相色谱法适合于大多数农药品种的定性分析。要求用两种不同极性色谱柱，农药纯品与标准物质的相对（绝对）保留时间一致或在允许范围内。顶空气相色谱法适用于残存在农药纯品中溶剂的定量分析。⑶.液相色谱法对热稳定性差、极性较强的农药非常适用，是气相色谱法的重要补充。要求用两种不同的流动相，农药纯品与标准物质的相对（绝对）保留时间一致或在允许范围内。⑷.质谱法现多采用气质或液质联用的分析方法。一次分析即可通过总离子流图获得农药纯品及其所含杂质的种类和面积归一化的信息。色质联用定性不仅仅是根据相对保留时间，更重要的可以获得农药纯品的分子量，特征离子碎片。不同的农药在慢电子轰击下裂解的离子碎片有其特征性。常用农药纯品定值的方法有：4.绝对测量法⑴.差示扫描量热法（DSC）属于一种热量分析技术。该方法是在程序控制温度下，测量输出物质与参比物的功率差与温度关系的一种技术。当试样发生任何物理或化学变化时，所释放或吸收的热量使样品温度高于或低于参比物的温度，从而相应地在差热曲线上可得到放热或吸热峰。差示扫描量热法具有快速、精确，试样用量少的优点，可测定农药的绝对纯度。DSC测定纯度是根据熔点或凝固点下降来确定杂质含量的，基本原理依据Van'tHoff方程。⑵.相溶解度分析法原理是当一种农药纯品在某一种溶剂中饱和时，其杂质不会饱和，根据其溶解杂质增量的变化，计算出农药纯品中杂质含量的方法。相溶解度法要求测量仪器精确可靠，能够重现。⑶.容量分析法可采用经典的化学容量滴定分析方法，如银量法、碘量法对农药纯品定值，但是这种方法应用有很大的局限性，它要求被测定农药要有特征的、无副反应的化学反应。5.相对测量法⑴.气相色谱法目前广泛应用的定值方法之一，快速简便，面积归一法假设的前提是检测器对各组分的响应因子均为1，但实际情况可能是检测器对有些杂质没响应或响应因子不等于1，对定值结果的准确性有一定影响。这种影响可通过其他定值方法加以校正。⑵.高效液相色谱法对于一种农药纯品的面积归一化定值，如果在紫外检测器有响应，最好在采用气相色谱法面积归一定值后，再采用高效液相色谱法定值，综合考虑给出该农药纯品的纯度值。⑶.元素分析法各种农药纯品依据其分子式，可计算出各种元素所占的比例，依此来分析判断该种农药的纯度。如除草醚的分子式为C12H7Cl2NO3，其中Cl占24.96%，N占4.93%，H占2.48%，C占50.73%。6.纯度值的统计分析与给定农药纯品在均匀性检验（包括瓶间、瓶内测定）的基础上，应给出纯度值。对一种农药纯品通常要采用3种以上的测定方法定值，每种方法测得5~8个值。对于一级标准物质至少有20个以上测定值。这些数据可参考有关文献进行统计分析。综合考虑各个影响定值的因素，给出每次测定的总平均值。在有些情况下，定值也采用从100%中减去杂质的做法，如减去水分、灰分、溶剂、酸度等杂质，然后给出最终的纯度值。7.2.4农药纯品制备和鉴定的实例在常温下，大多数农药以固态或液态两种形式存在，现以抗蚜威、敌敌畏两种杀虫剂为例，具体介绍农药纯品制备和鉴定的方法。1.抗蚜威（pirimicarb）化学名称：2-N,N-二甲基氨基-5,6-二甲基嘧啶-4-N,N-二甲基氨基甲酸酯（CASNo.23103-98-2）。结构式：分子式：C11H18N4O2分子量：238.2理化性质：纯品为无色无味结晶体，熔点90.5℃，30℃时蒸汽压为4×10-3Pa，25℃水中溶解度0.27g/100mL，溶于大多数有机溶剂，易溶于醇、酮、酯、芳烃、氯代烷烃。在一般条件下比较稳定，但遇到强酸或强碱，或在酸碱中煮沸则分解，水溶液见光易分解，无腐蚀性。⑴.提纯①.方法提要：样品用活性炭脱色后，在异丙醇中重结晶。②.试剂：抗蚜威原药，石油醚（60~90℃），活性炭（分析纯），异丙醇。③.仪器：烧杯、搅拌器、布氏抽滤装置、滤纸、锥形瓶、结晶皿、电热板、烘箱、研钵。④.操作步骤：用足够量的石油醚制备抗蚜威原药的悬浮液，在室温下搅拌5min后，布氏漏斗抽滤，弃掉石油醚。将布氏漏斗中的固体物转移至烧杯中，加入少量异丙醇，保持电热板的温度，使溶液不超过65℃，制备抗蚜威热饱和溶液。以2g/100mL的量加入脱色活性炭，加入活性炭时要防止爆沸。边加入边搅拌，在65℃条件下搅拌10min，然后趁热过滤，将滤液转入锥形瓶中，室温下放置过夜。用玻璃砂芯漏斗过滤结晶，（必要时再重结晶一次，但不加活性炭）将结晶体转移放在结晶皿内，于65℃烘箱内彻底干燥。将干燥后的结晶置于研钵内研磨成均匀的粉末，贮存在密闭的玻璃瓶中。⑵.鉴定定性①.熔点：采用CIPACMT2方法测定。抗蚜威mp.90.5℃。②.薄层色谱基本测定条件可参见CIPACMT164。用下列条件检验纯品中的杂质。硅胶GF254，板厚0.25mm，展开剂：二氯甲烷:丙酮=90:10（V/V），点样量：10%的抗蚜威三氯甲烷溶液，10L和50L两个点。Rf值：0.54，显色为UV254nm。在硅胶板上50L点样量应显示单一斑点，并且原点不显示出残留物。如可观察到杂质应继续重结晶。③.抗蚜威的红外光谱图④.抗蚜威质谱图(EI)定量①.溶剂含量采用气相色谱法，测定残存的异丙醇。色谱柱：玻璃填充柱1.8m×4mm内径，内装10%SE30/ChromosorbW-HP125m~149m(100~120目)；检测器：FID；温度：柱温：80℃（2min）230℃；气化室：220℃；检测室：250℃；进样：采用SGE固体进样器。正式分析样品前，先进一针空气，验证有无干扰峰的存在。然后取适量的固体样品进样，用面积归一化法确定溶剂所占的百分含量。②.灰分含量测定用5g的样品，按照CIPAC1AMT29的方法测定。③.水分含量的测定用1g的样品，按照CIPAC1AMT30.1的方法测定。④.采用毛细管气相色谱法测定纯度：色谱柱：12m长，涂OV-73；检测器：FID；温度：柱箱：60℃（1min）125℃（5min）270℃；气化室：250℃；检测室：300℃；气体流速：载气：H22mL/min(125℃)；尾吹气：N22mL/min(125℃)；燃气：氢气30mL/min(125℃)；助燃气：空气450mL/min；吹扫气：N24mL/min；不分流；进样量：1L（进样浓度为55mg/25mL正已烷）。扣除掉正已烷色谱峰面积值，用面积归一化法计算抗蚜威的含量。至少要称4~8个样本，进样分析，符合要求后计算出平均值，减去溶剂含量、灰分含量、水分含量后即为抗蚜威纯品纯度值。2.敌敌畏（dichlorvos）化学名称：O,O-二甲基-O-（2,2-二氯乙烯基）磷酸酯（CASNo.62-73-7）结构式：分子式：C4H7Cl2O4P分子量：220.98理化性质：纯品为无色油状液体，略带芳香气味。挥发性强。沸点74℃（133Pa），蒸汽压1.60Pa(20℃)，相对密度1.4(20℃)，挥发度145.0mg/m3(20℃)，折光系数1.45。在室温下水中的溶解度为1g/100mL，易溶于大多数有机溶剂。对热稳定。在酸性介质和水中缓慢分解，在碱性条件下迅速降解。对铁有一定的腐蚀性。⑴.提纯①.方法提要：将敌敌畏原油在以乙二醇做固定相、耐火砖为载体的色谱柱进行分离，进一步纯化采用减压蒸馏的方法。②.试剂：敌敌畏原油、乙二醇（分析纯）、石油醚（30~60℃，分析纯）、四氯化碳（分析纯）、二乙醚（分析纯）、无水硫酸钠、耐火砖250m~355m（40~60目）：先用蒸馏水彻底地洗干净，然后用丙酮清洗，过滤待溶剂挥发后，在105℃条件下干燥，用分级筛截取250m~355m粒度的耐火砖材料。③.仪器：厚壁玻璃管色谱柱，规格2.5m×50mm、旋转蒸发器、100mL馏分收集器、抽气泵：适合于石油醚四氯化碳混合溶剂（3:2，V/V），压力为100KPa，排气量为6L/hr、减压蒸馏装置：0.1Pa，70℃条件下工作，蒸馏瓶（100mL），具有10cm长的维格罗分馏柱，20cm长的冷凝器，尾端装有3分头的馏分收集器。图7-3液相色谱制备装置④.操作步骤：向装入2.5kg的耐火砖聚乙烯（大约厚0.1mm）袋中加入2.5kg的乙二醇，反复颠倒混合均匀。每次取50g填料装入色谱柱中，轻轻地填实。倒入石油醚四氯甲烷混合液（用乙二醇饱和）5.5L排除柱中的气体，然后用合适的进样环在柱顶部加入80mL敌敌畏原油（见图7-3）。以6L/hr的流速用石油醚四氯甲烷混合溶剂淋洗色谱柱，放弃前2L淋洗液，用100mL分馏瓶，收集后6L淋洗液用气相色谱法测定这些馏分，通常只有在25~55号馏分瓶中有敌敌畏。用旋转浓缩器蒸掉淋洗液，用400mL二乙醚溶解剩余溶液，先后2次各用300mL水清洗二乙醚层，然后用旋转浓缩器浓缩掉二乙醚。减压蒸馏敌敌畏，收集0.1Pa（55℃~60℃）条件下无色液体。收率可达50%。⑵.鉴定定性.敌敌畏红外光谱图.敌敌畏质谱图(EI)③.薄层色谱硅胶GF254板，紫外光254nm显色，展开剂：二氯甲烷:丙酮=4:1（V/V）。点样浓度为100g/L丙酮溶液，点样5L，展开后应为单点。定量①.水分含量按照CIPACMT30.1方法测定，含水量<0.02%(m/m)。②.酸度含量测定按照CIPACMT31方法，含量以H2SO4计，<0.02%(m/m)。③.气相色谱归一化法色谱柱：柱长1.5m×4mm内径，内装3%Reoplex100/GaschromQ74m~149m(100~200目)；检测器：FID；柱箱温度：100℃（2min）200℃；载气：N260mL/min；进样量：0.1L敌敌畏纯品；保留时间：约12min。用面积归一化法计算敌敌畏的含量。至少要称4~8个样本进样分析，符合要求后计算出平均值，减去水分，酸度含量即为敌敌畏纯品的纯度值。7.3残留分析方法可靠性的确认农药残留分析方法直接决定残留分析结果的真实程度。所以应尽可能采用国际或国家认可的标准方法，但在很多情况下，残留分析实验室使用非标准方法也可以保证方法的可靠性（credibility）。无论何种方法，对其可靠性的确认（validation）有以下要素：7.3.1方法的灵敏度分析方法的灵敏度(sensitivity)是指该方法对单位浓度或单位质量的待测物质的变化所引起的响应量变化的程度，它可以用仪器的响应量或其他指示量与对应的待测物质的浓度或量之比来描述，因此常用标准曲线的斜率来度量灵敏度。灵敏度因实验条件而变。在农药残留分析中，方法的灵敏度常用检测限（LOD,limitofdetection）或定量限（LOQ,limitofquantification）表示。检测限指由基质空白所产生的仪器背景信号的3倍值的相应量；或者以基质空白产生的背景信号平均值加上3倍的均数标准差。均以分析物质的浓度表示，单位μg/kg或mg/kg。定量限指由基质空白所产生的仪器背景信号的10倍值的相应量；或者以基质空白产生背景信号平均值加上10倍的均数标准差。均以分析物质的浓度表示，单位μg/kg或mg/kg。方法的灵敏度应该至少比该农药在指定的该作物上的最大残留限量低一个数量级。当样品中检测不出分析物质时，用“<LOD”表示，同时应指出方法的灵敏度。7.3.2方法的准确度准确度(accuracy)是用一个特定的分析程序所获得的分析结果（单次测定值和重复测定值的均值）与假定的真值之间符合程度的度量。它是反映分析方法或测定系统存在的系统误差和随机误差两者的综合指标。准确度用绝对误差和相对误差表示。评价准确度的方法大多数情况下是用加标回收率来表征，即在样品中加入标准物质，测定其回收率，以确定准确度，多次回收试验还可发现方法的系统误差，这是目前常用而方便的方法，其计算式是：………………（7………………（7.1）添加标准物质的量应与待测样品中存在的分析物质浓度范围相接近。一般设高、中、低3个浓度梯度，最高浓度不应超过标准曲线的线性范围。最低浓度也可按最低定量限（LOQ）设。每个浓度的样品重复数视要求而定，一般在3~12之间。加标和未加标试样分析期间必须相同处理以免出现试验偏差。7.3.3方法的精密度精密度（precision）是指用一特定的分析程序在受控条件下重复分析均一样品所得测定值的一致程度，它反映分析方法或测量系统所存在随机误差的大小。极差、平均偏差、相对平均偏差、标准偏差和相对标准偏差都可用来表示精密度大小，较常用的是标准偏差。在讨论精密度时，经常要遇到如下一些术语：1.平行性平行性系指在同一实验室中，当分析人员、分析设备和分析时间都相同时，用同一分析方法对同一样品进行双份或多份平行样测定结果之间的符合程度。2.重复性重复性系指在同一实验室内，当分析人员、分析设备和分析时间三因素中至少有一项不相同时，用同一分析方法对同一样品进行的两次或两次以上独立测定结果之间的符合程度。3.再现性再现性系指在不同实验室（分析人员、分析设备、甚至分析时间都不相同），用同一分析方法对同一样品进行多次测定结果之间的符合程度。方法精密度用变异系数（C.V.）表示。………………（7.2………………（7.2）根据Horwity方法，实验室内和实验室间分析方法的变异系数范围如表7-5。表7-5残留分析方法的实验室间和实验室内变异系数分析浓度C.V（%）实验室间实验室内10mg/kg1171mg/kg1611100g/kg231510g/kg32211g/kg45300.1g/kg64437.3.4方法的专一性专一性（specificity）指分析方法实际测定分析物质而不受杂质化合物干扰的能力。一般通过分析溶剂空白和样品基质空白来评价，以选择性系数来表征。选择性（selectivity）表示分析方法区别特性相近成份的能力，可表示为方法对样品中分析对象组分与其他组分（干扰杂质）灵敏度之比。若以△Ct表示分析对象组分浓度变化，△CI表示干扰组分浓度变化，设由此二者变化引起输出信号相等时，可规定选择性系数为：……………（7.3……………（7.3）假定对象组分浓度变化△Ct=1%时，输出信号为5mV；干扰组分浓度变化△CI=50%时，输出信号才为5mV，则：………（7………（7.4）也就是说该方法对于分析对象组分的灵敏度较干扰组分的灵敏度大50倍。一般在k=0.001时，即可认为样品中的干扰组分影响可忽略不计。如果样品中除对象组分外无干扰组分影响测定，则该方法是专一性的。一般在标准分析方法中应列举出影响测定专一性的干扰物质和去除干扰的方法。农药残留分析中的样品制备过程就是去除测定干扰物的过程。7.3.5校准曲线校准曲线（calibrationcurve）是表达被分析物质不同浓度与测定仪器响应值之间的线性定量关系的曲线。农药残留分析的校准曲线通常以标准溶液的不同系列浓度（最少应有5个点）为横座标、所得到的响应值为纵座标，连接各点得到相应的曲线，也称标准曲线。一般以最小二乘法处理数据，得出线性方程y=ax+b。该直线方程中的斜率a（回归系数）和截距b可按下式计算：…………………（7.5…………………（7.5）…………………（7…………………（7.6）对线性的相关系数r可按下式计算：…（7…（7.7）要求线性相关系数不得小于0.9995。7.4农药残留分析重要环节的质量控制根据欧盟农药残留监测指南对农药残留分析质量控制的要求，对残留分析的一些关键环节的质量控制是尤其重要的。7.4.1样品运输及贮存样品必须放置在洁净、牢固的容器或包装中运至实验室；样品在运输、贮存和在实验室处理时必须相互分离，并避免和任何潜在的污染物接触；分析易挥发的或熏蒸剂的残留样品必须用低通透性的袋子包装（如尼龙薄膜）；新鲜易碎易腐的样品（如草莓）应冰冻防止腐败，以干冰或类似方式运输并防止融化；会受冷冻损坏的样品（如香蕉）须防止过高、过低的温度。样品要迅速运送到实验室，新鲜样品最好在一天之内运到。实验室对所有样品的分析都应近可能在最短时间内完成，测定不稳定的或挥发性的农药残留时，应在样品到达当天就立即开始。当不稳定的残留农药易损失时，样品可以在冰冻条件下（如干冰存在下）粉碎。实验室对样品的加工处理和贮存过程应能证明对样品中的残留农药没有明显影响。7.4.2农药纯品与标准溶液配制1.每种农药纯品应明确标出接受日期和有效期，在有效期过后，如果其纯度仍可接受，则可以保留纯品并确定一个新的有效期限。新的和旧的纯品的相对纯度可以通过比较其新配溶液在检测器中的响应来确定。每次新进的纯品都应对其特性进行检查。纯品应按供应商的指导进行贮存，一般是放置于干燥器内贮存在黑暗低温条件下，容器须密封以防止水份进入。贮存期间应使降解最小化。2.配制标准溶液配制标准溶液和工作标准溶液须按照以下要求进行：⑴.分析纯品包括内标物不可与配制溶剂存在任何反应，要有适当溶解性，所用溶剂必须适合分析方法且与测定系统共容。每次配制称取纯品量不应少于5-10mg，如果纯品为挥发性液体应以重量或体积直接溶入溶剂。⑵.配制的标准溶液应注明有效期，超过有效期的标准溶液一般应弃去。新配制的标准溶液要与将要弃置的溶液测试比较，如果新溶液测定均值与旧溶液均值的差异＞±5%，则要更新配制的溶液，与测试的新溶液进行测试比较来检查其准确性。如果拟弃置的旧标准溶液测定中产生的响应小于或等于新配制溶液响应的95%，则标准溶液贮存的时间应缩短，或者贮存条件应改善。如果新、旧标准溶液的响应没有显著差异，则可考虑更长贮存时间。⑶.标准溶液要避免光照；要密封以避免溶剂挥发和进入水分；贮存在黑暗低温下的冰箱或冷冻箱内；从低温贮存下取出的溶液在室温下平衡后，用前要摇匀。如果在低温下的溶解性有限，则标准溶液从低温下取出后一定要极为小心使其完全溶解。7.4.3防止实验室污染和干扰农药残留实验室内或附近严禁使用任何农药；残留分析所用玻璃容、量器要避免使用劣质和刻蚀的器皿，所有器皿必须彻底清洗洁净（应尽可能分别以固定的器皿用于标准溶液和样品提取，以避免交叉污染）；仪器、容器、溶剂（包括水）、试剂、过滤器材等均应检查可能的干扰源。注意橡胶、塑料器皿以及润滑剂等都是经常的干扰源。来自样品天然成分的干扰物如果与农药残留的响应重叠，则应采用另外不同的净化或检测系统。7.4.4减少提取和浓缩过程的残留农药损失提取时样品应彻底粉碎以得到最大的提取效率，温度、pH等参数如果影响提取效率则要加以适当控制。提取液浓缩蒸发时溶剂不可全干，因为很多痕量物质在此时损失很大。为避免这种情况，可以加少量高沸点溶剂作为“保护剂”。浓缩中温度要尽可能低，避免提取液沸腾起泡或液滴溅散。小体积的提取液浓缩一般用N2流或真空减压蒸发而不用空气流，因为空气会造成氧化反应或引入水分和其它污染物。在对残留分析方法进行生效试验时，要研究提取液中农药残留的稳定性。7.4.5回收率测定与校准1.回收率测定⑴.进行样品的残留分析时，每一批样品测定都应做所有分析农药的回收率测定。但如果在多残留分析中，测定量太大，进行回收率测定的最低要求是：每一批样品测定中，选择几种代表性农药进行回收率测定，每次回收测定的添加回收浓度≥2个水平（包括LCL），在回收率测定的滚动计划中，每种农药都应进行一次回收率测定。当一种农药残留包含几种成分且都有MRL规定时，只要可能，所有残留成分都应作常规回收率测定。但当这些成分是相同的分子时，常规回收可以只测定主要残留成分或只测回收率最低的成分。.回收率的添加量应在LCL或MRL1-10倍的范围，也可以针对相应分析样品的残留浓度为添加量。添加浓度可以有规律地间歇性地变化，以了解整个添加浓度范围内的分析效率。在LCL或MRL水平的回收率特别重要。添加空白测定时，如果得不到完全空白的试样，则添加浓度应是空白试样所存在的本底浓度≥5倍，此本底浓度应从多个样份中重复测定确定。⑶.回收效率的可接受性①.常规回收率在60%~140%范围内都是可以接受的，当常规回收率不可接受地低时，该批样品要重新分析；但是当回收率虽低，但精确度很好，低于60%的回收率也可接受，但应尽可能改用更准确的方法。当回收率不可接受地高，样品中又未测出残留时，就不必对该批样品重新分析来确证有无残留存在。但要研究过高回收率的原因。如果回收率略微超过60%~140%的范围，该批样品的测定结果可以考虑为半定量的。但如果回收率显著超出这个范围，则该批残留数据没有价值。②.超过MRL的残留数据回收率必须在70%~110%范围内，如果达不到这一范围的回收率，执法行动不受影响，但要考虑准确性较差的因素。③.回收率测定并不证明分析结果的所有准确性和精确性。残留分析实验室必须定期参加有关的熟练性测试，测试中准确性有问题或不可接受时，应研究问题的原因并作纠正后，才可以作进一步的分析工作。2.校准⑴.每一批残留分析样品都必须进行校准，但如果多残留分析时校准测定数量太大，可以选择代表性的农药（也称做参照农药）在每一批分析时校准，但被代表的所有其他农药至少每6个月都应该在滚动计划中分析一次，每次校准要求≥2个浓度水平（包括LCL）。必须小心地选择代表性的农药，选择应按照所有分析农药能从分析的样品中检出的原则；这些农药可能有最差、最多变化的响应和/或回收率。当样品中检测到一种农药残留时，必须对该样品再进行一次分析，同时进行检出农药的校准和回收，在该农药残留量接近或超出MRL时更必须如此。如果被代表的农药在滚动计划的回收或校准分析中产生不可接受的结果，则该农药此前成功回收或校准之后产生的所有结果都必须作为假阴性处理。⑵.在最低校准水平（LCL,Lowestcalibratedlevel）之下的残留报告时表示为＜LCL，如果必须对此残留定量，则必须确定更低的LCL并对样品重新测定。当校准测定应用3个以上浓度水平时，可以计算合适的校准函数绘成校准曲线，但如果个别点偏离校准曲线大于±20%（在接近或超过MRL值时大于±10%）则需要用更好的校准函数，或者重新进行测定。在2个浓度水平进行内插法校准也是可以接受的，但每个浓度水平重复之间的较高响应因子不可大于较低响应因子的120%（在MRL左右时为110%）。如果检测器响应随时间变化，用单浓度水平校准比多浓度水平校准更准确时，如果大于MRL值，样品响应应在校准标准响应的±10%以内，如未超过MRL，样品响应则应在校准标准响应的±50%以内。当提取液中含高浓度水平的残留时，应稀释至校准范围内测定。⑶.一批测定的样品数量调节，按照在线性范围内校准标准溶液的检测器响应漂移，在≥2倍LCL时不大于30%；在接近或超过MRL值时，则分别为不大于10%和15%。当漂移超过这些值时，如果样品中明显不含有残留，且整批样品测定LCL响应均保持可以测定状态，则样品不必重复测定。但是当结果为阳性或测定回收率时，则必须在可接受的漂移范围内设置重复数来进行定量测定。7.5残留分析结果的表达与数据处理7.5.1残留分析结果的记录和取舍1.有效数字为了得到准确的测定结果，不仅要确切地反映测量的精确程度，而且要准确记录和计算。记录的数字不仅表示数量的大小，而且还反映测量的精确程度。例如，在配制残留分析标准溶液时，用感量为万分之一克的分析天平称取某农药的质量为0.5180克，它不仅表明该农药标准品的具体质量，也表示最后一位数字“0”是可疑的，即其实际质量在0.5180±0.0001克范围内的某一数值，此时称量的绝对误差为±0.0001克，相对误差为：如果将称量结果写成0.518克，则该农药标准品的实际质量将为0.518±0.001克范围内的某一数值，其绝对误差为±0.001克，相当于感量为千分之一的工业天平的精度，而相对误差为：可见，记录时多写一位或少写一位数字，从数学角度看关系不大，而从分析化学角度看，记录所反映的测量精确度无形中被夸大或缩小了10倍。所以在数据中代表一定量的每一个数字都是重要的，这种数字称为“有效数字”。在残留量测定过程中，往往要经过几个不同的测量环节。如样品的称量、溶液的定容、待测溶液的量取和测定结果的报出等，由于各个操作环节的测量工具各异，精度也不甚一致，这些数据的准确程度不一定完全相等，确定该用几位数字来表达测量或计算的结果非常重要。有人认为在一个数值中小数点后面的位数愈多，这个数字愈准确，或在计算结果中，保留的位数愈多，准确度便大，这两种理解都是片面的。第一种理解的缺陷，在于没有弄清小数点的位置不是决定准确度的标准，小数点的位置仅与所用的计量单位有关。例如，记某残留分析试液体积为21.3，与0.0213mL的准确度完全相同；记质量0.0025mg与2.5g的准确度亦相同。第二种理解的缺陷，在于不了解所有测量值，由于仪器和感官的局限性，只能作到一定的准确度。这个准确度一方面决定于所用仪器刻度的精密程度或灵敏程度，另一方面也与分析者所用的方法有关。因此，在计算结果中，无论写多少位数，绝不能把准确度增加到超过测量能力所及的允许范围。反之，表示一个数字时，书写位数过少，低于测量所能达到的精度，同样是不合理的。正确的写法，所给出的数字的位数，除末位数字为可疑或不确定外，其余各位数都应该是确切知道的。在运算精度不相等的数值时，首先应确定有效数的位数。其中数字“0”，它可以是有效数，也可以不是有效数。数字前的“0”不是有效位数，数字后的“0”表示有效数位数。例如，从微量注射器上读取25.03和感量为万分之一的天平称量1.2004g这二个数据中，所有的“0”均为有效数；而在残留量0.0032mg/kg中的“0”则为非有效数字，它只与所用单位有关，而与测量精度无关，若改用g/kg，则原数中两个“0”全消失，变成3.2g/kg，所以0.0032mg/kg有效数只有二位，其中“0”是无效数。3.4×102，2.15×103，这类数据写法所表示的有效数位数，可按10n以前的数字确定，则应分别为二、三位。3.4×102是二位有效数字，表示340中的“4”是可变动的，其可能范围在330-350之间，若把3.4×102改写成340，则为三位有效数，表示数值在339-341之间变动的可能。在数据处理中还经常遇到一些乘子（如倍数或分数关系等）。例如，将含农药残留的50.0g土壤样品，经处理后得定容试液5.00mL，从中吸取20.00，即吸出20/5000，相当于样品量的1/250，这里的1、20、250、5000表示自然数，并非测得值，没有不定数字，属于无限多位有效数字，需要几位就可以几位。常数π、e等数值的有效数位数，亦可认为是无限制的。2.有效数字运算法则在农药残留量的测定中，由各操作环节得到的测量值，其有效数字的位数通常不相等，必须按一定规则进行计算，否则，任意取舍有效数字，会影响计算的准确性。有效数字的计算通常遵循以下原则：⑴.记录测量数值时，只保留一位可疑数字，除非另有规定外，可疑数字表示末位上有±1个单位或其下一位有±5个单位的误差。如感量为万分之一克的分析天平，感量为百分之一克的扭力天平和感量为十分之一克的台式天平，称量时必须分别记录到小数点以后四位、二位和一位；滴定管、移液管、刻度定容试管、微量注射器等，可以记读到小数以后第二位。例如，微量注射器中面正好在15刻度线上，则应记录为15.00。⑵.当有效数位数确定后，其余数字应一律弃去。整数中多余数字舍去后用0代替，其它各数舍弃的办法，一般按四舍五入或四舍六入五留双的方法。前者是当尾数≤4时弃去，≥5时进位；后者是当尾数≤4时弃去，≥6时进位，当尾数为5时，如进位后得偶数则进位，弃去后得偶数则弃去。例如，将2.604、2.605、2.615分别处理成三位有效数字，用四舍五入方法分别得2.60、2.61、2.