中药安脑片对异体移植小鼠agvhd的干预作用

中药安脑片对异体移植小鼠agvhd的干预作用

急性移植物抗香剂（agvwd）发生在缺血干移植的早期阶段，这是移植早期阶段受害者死亡的主要原因。1材料和方法1.1小鼠体质量变化实验动物为广州中医药大学实验动物中心提供。供鼠:SPF级Balb/cH-2d小鼠10只,8~l0周龄,雄性,体质量(20±2)g;受鼠:SPF级C57BL/6H-2b小鼠20只,10~12周龄,雌性,体质量(20±2)g。小鼠在广州中医药大学动物中心SPF级动物房内笼中饲养。1.2猪汁液粉、麻黄、郁金、珍珠母、病毒等3种药物组成安脑片:哈尔滨东方制药生产,薄膜衣片,0.5g/片,主要成份:人工牛黄、水牛角浓缩粉、猪胆汁粉、黄连、黄芩、郁金、珍珠母、珍珠、雄黄、冰片、朱砂、薄荷脑等15味药物组成,攻效:清热解毒。生产批号为:20100701,上药购自广东省中医院中药房,灌胃前用0.9%生理盐水临时配成药液,配药浓度为0.1g/ml。分装成100ml瓶备用,以便动物灌服。1.4胶片和病理切片机倒置相差显微镜(Leica公司),OLYMPUS倒置显微镜(CK-2,日本),OLYMPUS照相系统(PM-CBAD,日本),病理切片机。PPCT-ZB型超声波多功能快速组织脱水机(襄樊徕卡生物电子仪四厂生产),OCT包埋剂。1.5小鼠的生存时间测定观察有无腹泻、体质量减轻、弓背、翘毛、精神萎靡和皮肤溃疡等表现,移植前将小鼠分别称质量并记录,移植后每3天称质量1次,直至小鼠死亡,并记录各组小鼠生存时间。根据文献[2],对临床aGVHD评分标准进行改良(表1),由翘毛、皮肤溃疡、腹泻、体质量下降、姿势、活动度等指标组成,每项评分超过1.5分,或临床总评分超过3分以上,视为aGVHD发作。1.6标准溶液配制移植后第30天,取各组小鼠部分肝脏、皮肤、小肠组织,用纱布块包好,制作病理标本,大小为2cm×1.5cm×0.5cm。将上述组织块放入10%中性甲醛溶液固定、丙酮脱水、浸蜡、包埋,常规切片、捞片、中性树胶封固,行普通苏木素一伊红(HE)染色;采用多媒体彩色病理图文分析系统进行图象分析,并按照Thomas标准1.7统计学处理方法所有数据用均数±标准差表示,采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理,生存分析采用Kaplan-Meier法进行,2组比较采用非参数检验Chi-Squaretest法进行比较;以α=0.05为检验水准。2结果2.1安脑片与空白组的生存情况比较观察期间,空白组小鼠在移植后第15天全部死亡,死亡率100%,平均生存时间平均为11.9d。安脑片组死亡3只,存活率70%,平均生存时间平均为27.3d,较空白组明显延长,差异显著(P=0.000)。存活的小鼠继续观察,最长存活时间长达86d,平均生存时间为65.4d,具体见表2及图2,显著统计学意义。2.2腹泻大鼠总体质量、死亡情况空白组小鼠在移植后第2天开始出现精神萎靡,喜蜷卧,进食减少,竖毛,毛发脱落,弓背,腹泻,其中5号鼠腹泻2~3次/d,总体质量下降达8g左右(图3a),死亡数量增加,死亡后解剖肉眼见:肝脏颜色变黑、肠腔肿胀、坏死(图3b)。安脑片组小鼠在移植早期,出现精神萎靡、蜷卧、进食下降的现象,但第12天精神状态开始恢复,喜动,饮食基本如常,体质量增加,毛发光泽,大便如常(图3c)。2.3组患者皮肤表现、腹泻,体质量及活动度评分情况比较根据上述制订的临床aGVHD评分标准,空白组小鼠皮肤表现为明显的翘毛或皮肤溃疡,蜷卧,活动度下降,腹泻,体质量下降,其皮肤表现、腹泻、体质量减轻、姿势及活动度的评分分别为2.70±0.48、2.90±0.32、2.91±0.34、2.80±0.42,总评分为3.00±0.00,而安脑片组整体情况较空白组好,评分分别为0.10±0.32、0.20±0.42、0.12±0.00、0.10±0.10,总分为0.31±0.14,2组比较,差异明显(P=0.026),见表3。2.4小鼠小鼠黏膜组织病理学检测光镜下,空白组小鼠可见肝内大量淋巴细胞浸润,胆管上皮细胞坏死、脱落,肝细胞重度水肿、呈气球样变,肝索结构破坏(图4a)。安脑片组小鼠肝组织肝索清晰、整齐,肝细胞结构正常,肝细胞含较多糖原,汇管区结构正常,少量炎细胞浸润(图5a)。空白组小鼠小肠粘膜全层和肌层均有单核细胞和淋巴细胞浸润,小肠粘膜变薄,部分绒毛消失,管腔上皮细胞坏死(图4b)。安脑片组小肠粘膜固有层单核细胞浸润,粘膜下层和肌层无炎性细胞,管腔粘膜变薄,绒毛及腺体隐窝结构完整,粘膜部分脱落,肌层变薄,无溶解和坏死现象(图5b),空白组小鼠皮肤表皮结构破坏,可见坏死和溃疡形成,真皮充血、水肿,炎细胞浸润,皮脂腺胞部份破坏,形成空泡(图4c)。安脑片组皮肤表皮结构完整,个别区域轻度萎缩,真皮层乳头层清晰,胶原纤维正常排列,皮脂腺消失或明显减少(图5c)。2.5小鼠肝脏及小鼠agvhd的比较组织病理的观察通过2位有5年以上经验的临床病理学家双盲阅片,根据标准,结果分级如下(表4):空白组小鼠肝脏、小肠及皮肤均发生不同程度的aGVHD,发生率占100%,其中肝脏发生Ⅱ级2例,Ⅲ级5例,Ⅳ级3例,小肠发生Ⅱ级1例,Ⅲ级3例,Ⅳ级5例,皮肤发生Ⅰ级4例,Ⅱ级3例,Ⅲ级2例,Ⅳ级1例。安脑片组小鼠发生aGVHD的比例也为100%,但程度较对照组明显减轻,其中肝脏发生0~Ⅰ级5例,Ⅱ级4例,Ⅲ级1例,小肠发生0~Ⅰ级5例,Ⅱ级3例,Ⅲ级1例,Ⅳ级1例,皮肤发生0~Ⅰ级8例,Ⅱ级2例,发生0~Ⅰ级肝脏、小肠、皮肤aGVHD分别占50%、50%、80%。提示安脑片在改善aGVHD病理方面的总体效果是明显的(χ3关于aghvd的干预急性移植物抗宿主病是由于供者T细胞进入受者体内,在第一信号和第二信号调节下活化增殖为效应细胞,产生大量IL-1、TNF-α、IFN-γ等多种细胞因子,造成相应组织器官的损害,此即为“细胞因子风暴(cytokinestorm)”学说本研究以SPF级Balb/c雄性小鼠作为供鼠,以SPF级C57BL/6雌性小鼠为受鼠,进行异体骨髓移植,移植前受鼠进行临床表现方面,Lu等研究为什么安脑片具有良好的干预aGHVD效应呢?中药的现代药理研究表明,方中雄黄具有解毒、杀虫、燥湿、祛风等功能,其主要成分为四硫化四砷(AS安脑片是通过什么样的机制发挥其干预效果?是通过调节T淋巴细胞亚群的紊乱,降低IL-1、IFN-γ等Th1类细胞