微生物生长与培养技术-常用微生物培养方法

平板划线法

在无菌环境下，用接种环蘸取少许样品，以平行划线、扇形划线或其他形式在固体培养基表面连续划线，微生物细胞数量随着划线次数逐渐减少，形成单菌落。稀释到平板法通过液体稀释的方法分散样品中的微生物细胞，常用十倍梯度稀释法。随着稀释次数的增加，单位体积中菌体数量减少，细胞得以分散。选取适宜的稀释进行倒（涂）平板，经过适宜的培养可以获得单菌落。单孢子或单细胞分离法

采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养，从而获得单菌落。利用选择培养基分离法

微生物对不同的化学试剂、抗生素等具有不同的抵抗力，利用这些特性配制合适某种微生物生长而限制其他微生物生长的选择性培养基，从而获得特定微生物的纯培养。根据培养基物理状态不同，微生物培养技术分为固体培养法和液体培养法。固体培养法多在试管斜面、平板、克氏扁瓶、茄子瓶中进行。液体培养基多在试管、三角瓶中进行，将接种后的培养器皿在适宜条件下进行摇瓶培养，实现目的微生物的增殖。

谢谢观看所谓接种（inoculation）就是将一定量的纯种微生物在无菌条件下转移至另一已灭菌且适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。微生物接种技术是进行微生物实验的基本技术。

接种工具：接种工具即微生物分离、移接时所用的工具。首先我们一起认识几种常用的接种工具吧。接种概念接种工具1.接种针；2.接种环；3.接种圈；4.接种刀；5.接种耙；6.玻璃涂棒1．接种针用于挑取细小菌落和从菌褶中挑取孢子。

2．接种环接种针先端用尖嘴钳弯制成一个圆圈。用于银耳芽孢分离转管或蘸取孢子悬液在斜面、平板上拖制、分离用。

3．接种圈接种针先端用尖嘴钳缠绕成圆形扁平状。用于蘸取孢子，抖落于斜面或平板上。

4．接种刀用于纵切斜面菌种和挑取菌丝体转管，也可用于组织分离时切割、移接组织块。

5．接种耙接种耙材料制法与接种刀相似，仅前端弯制成90°角呈耙形，先端需挫锋利。用于横切斜面菌种或直接切断母种斜面移接入二级菌种料瓶内。

6．玻璃涂棒用于菌种分离，把稀释菌液在平板上涂布均匀获得单菌落。接种方法：微生物接种是微生物学研究中最常用的基本操作，主要用于微生物的分离纯化。不同的培养基，接种方法也不同，主要有以下几种方法：

1．试管斜面接种方法：即将单一菌落或一支已长好的斜面菌种转移至另一支斜面培养基上的接种方法。该方法主要用于纯菌的增殖、鉴定和保存。2固体平板接种方法：平板接种法可分为平板划线法、倾注平板法和涂布平板法。

平板划线法示意图倾注法示意图涂布法示意图谢谢一、涂布平板法即将菌体样品均匀地涂布于固体培养基表面。该方法适合菌体的分离、纯化、计数。1．融化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制备培养基平板。并标记3个10-5，3个10-6，3个10-7。2.选取10-5，10-6，10-7三个稀释度。用无菌吸管吸取0.1ml10-5稀释液滴加到编号10-5的3个培养基表面。3.将玻璃涂布棒在酒精灯火焰上进行灼烧，待冷却后，用涂布棒将菌液均匀涂布在培养基表面。10-6，10-7两个稀释液按上述方法进行涂布。4.玻璃涂布棒使用后，进行灼烧灭菌，以免造成污染。5.待培养基表面菌液被培养基吸收后，将平皿倒置于37℃下培养1-2d，定期观察，记录结果并进行计算。二、倾注法即将菌体样品在溶化的固体培养基中充分混匀，倒入培养皿中冷却凝固。经培养后，菌体细胞在培养基内部和表面形成肉眼可见的菌落。该方法适合兼性厌氧菌的培养、计数。1．选取10-5,10-6，10-7三个稀释度。用无菌吸管吸取0.5mL10-5稀释液放入编号10-5的3个平皿中，同法分别吸取10-6,10-7的稀释液，放入编号10-6,10-7的3个平皿。2．然后在9个平皿中分别倒入15mL已融化并冷却至45℃的培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置。3.将培养皿倒置于37℃下培养1-2d，定期观察，记录结果并进行计算。涂布和倾注接种示意图三、平板划线法即把杂菌样品通过在平板表面划线稀释获得单菌落的方法。1．接种前使用酒精棉球擦拭双手，要在待接平皿上做好标签，注明菌株名称和接种日期。2.点燃酒精灯，灯焰周围约1-2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可以避免污染。3.右手持接种环，将接种环的金属丝直立于酒精灯外焰外，灼烧至红透，然后略倾斜接种环，灼烧金属杆。注意灼烧时要将金属丝与金属杆的连接部分充分灼烧。4.左手持斜面的底部，将管口置于火焰的无菌区，右手小指打开试管塞，将接种环深入斜面，待稍凉，刮去少量菌体。5.左手取平皿一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角度小于30°，将接种环上的菌种按图示进行划线。A区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。C区或D区要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。6.划线结束，接种环要灼烧灭菌，才能放回原处，以免污染。7.将接种完毕的平板置于37℃下培养1-2d，定期观察，记录结果。划线接种示意图谢谢病毒的繁殖：病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制”。病毒复制的过程分为吸附、侵入脱壳、生物合成及装配释放四个步骤，又称复制周期。病毒繁殖过程动物接种：这是最原始的病毒培养方法。常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔，有时也用猴、猿、猩猩等。对于动物的选择，应满足一下标准：①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗的健康动物；②对相应病毒易感，并十分敏感；③家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确，并符合普通级实验动物标准；④动物的体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。病毒。按病毒侵袭部位不同选择适当的接种途径，有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等，如嗜神经病毒接种在小鼠的脑内。接种后通常以动物发病、死亡作为感染指标。此接种方法不需要复杂的仪器设备，且结束简单，易成功，然而其存在个体差异大、价格昂贵、需要隔离畜舍等缺点。禽胚培养法：鸡胚接种该方法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。根据病毒种类不同，可将病毒样本接种于鸡胚的羊膜腔、绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊中。①羊膜腔接种，应用于从临床材料中分离流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。②绒毛尿囊膜接种，常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离，这些病毒能够在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点或痘疱状病灶。另外，病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定，通过产生的班和痘来计算病毒颗粒的数目。③尿囊腔接种，应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养。这些病毒被接种到尿腔囊后，可在内皮细胞中复制，复制的病毒被释放到尿囊液中。因此，在尿囊液中含有大量的病毒。④卵黄囊接种，主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体等的分离和繁殖。这些大的病原体主要在卵黄囊的内皮细胞生长，且生长速度很快，立克次体染色后也可看到。禽胚接种部位细胞培养法：细胞培养是指利用机械、酶或化学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至2~4个细胞团悬液进行培养。根据细胞的来源，染色体特性及传代次数可以将细胞分为原代细胞、细胞株、传代细胞。原代细胞是指新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，此类细胞最适合分离病毒，然而易含有潜伏病毒；细胞株，又称二倍体细胞，指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物性质和标记的细胞。这类细胞能保持原来的二倍染色体数目。此类细胞碎片少，细胞均匀，潜伏病毒易发现，对病毒的敏感性与原代细胞相似；传代细胞，能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性均类似于恶性肿瘤细胞，多源于癌细胞。此类细胞容易培养，且生长迅速、易得，然而其对分离病毒不敏感，且对设备要求高。谢谢试管斜面接种的概念：斜面接种是从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面的方法，是微生物学中最常用、最基本的技术之一。该方法主要用于纯菌的增殖、鉴定和保存。试管斜面接种的操作步骤及要求：1．接种前使用酒精棉球擦拭双手，要在待接种试管上做好标签，注明菌株名称和接种日期。2.点燃酒精灯，灯焰周围约1-2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可以避免污染。3．右手拿接种环，先垂直、后水平方向把接种环放在火焰上灼烧（a）。凡是需进入试管的杆部分均通过火焰灼烧，下端环心必须烧红，彻底灭菌。灼烧时，应把环放在酒精灯的外焰上，因为外焰温度高，易于烧红。4．将菌种斜面和新培养基斜面同时握于左手中，管内斜面向上，用右手的小指、无名指和手掌在火焰旁拔去两支试管的棉塞（b），并使管口在火焰上通过（c），以烧死试管口的杂菌，随后把管口移至火焰近旁约1-2cm。试管斜面接种的操作步骤及要求：5．将烧过的接种环伸入菌种管内，先使接触斜面上端的培养基或管壁，使接种环充分冷却，待培养基不再被接种环融化时，可将接种环伸向斜面中部蘸取少量菌体，然后小心从试管中抽出（d）。注意不能让环心接触管壁和管口。取出后接种环不能通过火焰。接种环不能通过火焰，在火焰旁迅速伸入新培养基斜面，在斜面下1/5处，由下至上轻轻划线（e）。注意不要讲培养基划破，也不要将菌体沾在管壁上。6.接种完毕，试管口必须迅速通过火焰灭菌，在火焰旁塞入棉塞（f,g）。注意不要使试管离开火焰去迎棉塞，以免进入带菌空气。操作中如果不慎使棉塞着火，要迅速塞入试管内，由于缺氧火自然就会熄灭；若棉塞外端任然着火，也不要用嘴吹，迅速用手捏几下，即可熄灭。7.划线结束，接种环要灼烧灭菌（h），才能放回原处，以免污染。放回接种环后，将斜面置于37℃下培养1-2d，定期观察，记录结果。试管斜面接种法谢谢工业规模化培养方法工业中固体培养法分为浅盘法、转桶法和厚层培养法。固体发酵具有操作简便、能耗低、发酵过程易控制，对无菌要求相对较低，不易发生大面积的污染等优点，然而仅适用于真菌发酵。工业中液体培养常使用液体静置培养法、深层通气培养法。液体静置培养法多见于工业生产中厌氧微生物的培养。深层通气培养法是基于发酵罐进行的培养方法。常用的发酵罐：通用型搅拌发酵罐、气升式型发酵罐。图5-5微生物工业生产过程工业生产中，微生物的培养过程大致可以分为四个阶段，即：菌种阶段、种子扩大培养阶段、发酵阶段和提炼阶段

谢谢观看原理

在土壤环境中存在着大量的微生物，且绝大多数都是混杂生活在一起。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据其特定的生长条件（如营养、酸碱度、氧等），供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他微生物的生长，再通过稀释涂布法或稀释倒平板法分离纯化微生物。不同种类的微生物对营养需求各不相同，培养基是人工将多种物质按照特定微生物生长需要配制而成的一种混合营养基质。培养细菌常用的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基；高氏一号合成培养基适合培养放线菌；PDA培养基适宜真菌的生长。土壤中不同种类微生物的存在概率不一样，因此为了得到特定微生物，除了应使用相应的培养基外，还要选择合适的稀释度。如果出现概率较高，则稀释度要高，反之则低。当测定土壤细菌数量时，多采用10-4，10-5,10-6稀释度；当测定土壤放线菌和霉菌数量时，多采用10-3，10-4,10-5稀释度。菌落形态是进行微生物分离纯化的依据之一。方法与步骤（一）培养基准备培养基类别培养基原料培养基灭菌适宜微生物种类牛肉膏蛋白胨培养基（200ml）牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，水，自然PH将牛肉膏、蛋白胨溶入烧杯中，搅拌至溶解，加水至200mL，后加入琼脂，121℃高压灭20min。细菌高氏一号培养基（200mL）可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，FeSO4·7H2O，琼脂，水，pH7.4-7.6首先将FeSO4·7H2O配制为母液。将淀粉加入烧杯搅拌溶解，再依次将KNO3，K2HPO4，MgSO4·7H2O，NaCl，FeSO4溶液。加水至200mL后调节pH至7.4-7.6，加入琼脂，121℃高压灭20min放线菌PDA培养基（含蔗糖，200mL）马铃薯，蔗糖，琼脂，水，自然PH将称好的马铃薯煮30min,用纱布进行过滤，保留滤液。将蔗糖溶于滤液中，加水补至200mL，加入琼脂，121℃高压灭20min霉菌PDA培养基（含葡萄糖，200mL）马铃薯，葡萄糖，琼脂，水，自然PH将称好的马铃薯煮30min,用纱布进行过滤，保留滤液。将葡萄糖溶于滤液中，加水补至200mL，加入琼脂，115℃高压灭20min酵母（二）微生物的分离1．接种前使用酒精棉球擦拭双手，点燃酒精灯，灯焰周围约1-2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可以避免污染。2.倒平板。右手持盛有溶化培养基的三角瓶，置火焰旁边；左手拿平皿，用手掌边缘和小指、无名指拔出瓶塞，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一条缝隙，迅速倒入培养基，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后备用。3.制备土壤稀释液。称取土样5g，放入程又45mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇20min，使土样与无菌水充分混合，制成土壤悬液。进行梯度稀释，方法参照技能实训6-2，制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6各种稀释度4.选取适宜的稀释度。用无菌吸管吸取0.1mL稀释液滴加到不同的培养基表面。将玻璃涂布棒在酒精灯火焰上进行灼烧，待冷却后，用涂布棒将菌液均匀涂布在培养基表面。5.玻璃涂布棒使用后，进行灼烧灭菌，以免造成污染。6.待培养基表面菌液被培养基吸收后，将平皿倒置于37℃下培养1-2d，定期观察。（三）微生物的观察

1.观察微生物的菌落特征。2.通过显微镜观察微生物的形态。注意事项1．选择正确的培养基是培养特定微生物的前提。2．整个操作过程需要进行无菌操作谢谢平板计数原理平板菌落计数法，又称活菌计数法，是将待测菌液经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。该方法被广泛应用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水等的含菌指数或污染程度的检测平板计数的操作步骤梯度稀释1．接种前使用酒精棉球擦拭双手，要在试管上做好标签，标记10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6等。2.点燃酒精灯，灯焰周围约1-2cm处的空间为无菌区，所以在酒精灯灯焰旁进行无菌操作法接种，可以避免污染。3．用移液管吸取4.5mL无菌水于各个试管中。用1mL无菌吸管吸取0.5mL混匀的大肠杆菌菌悬液，精确的放入10-1的试管中，此为10倍稀释。将10-1试管置于涡旋振荡器上振荡，充分混匀菌液。用吸管从10-1试管中吸取0.5mL稀释液，精确的放入10-2的试管中，充分混匀菌液，此为100倍稀释。其余以此类推。

待测菌液是适度的选择应根据样品的浓度确定。当样品中所含待测菌的数量较多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂时，多采用10-7，10-8,10-9稀释度；当测定土壤细菌数量时，多采用10-4，10-5,10-6稀释度；当测定土壤放线菌和霉菌数量时，多采用10-3，10-4,10-5稀释度。注意事项1．选择适当的菌液稀释度对结果的精确性有重要影响，一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度培养后所出现的而平均菌落数在50个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。2．混菌法倒培养基时应当注意培养基不能过烫，否则会杀死微生物；培养基也不能过冷，否则不利于菌与培养基混匀，影响计数。3．全程需要进行无菌操作谢谢禽胚繁殖病毒原理鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一。来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。目前鸡胚尤其是SPF级鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养。禽胚结构鸡胚是由三个胚层发育而来的，即外胚层、中胚层和内胚层，它们构成胚胎的组织与器官。禽胚接种部位可分为尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种和绒毛尿囊膜接种。不同鸡胚接种途径的应用接种途径病毒的适用范围尿囊腔接种流感病毒、新城鸡瘟病毒、腮腺炎病毒羊膜腔接种临床材料（如患者的鼻洗液及咽漱液）分离病毒卵黄囊接种抗流感病毒药物绒毛尿囊膜流感病毒滴定、中和试验、药物实验实训方法与步骤（一）鸡胚的孵化1.鸡胚