蛋白质层析技术课件

蛋白质层析技术蛋白质层析技术1蛋白质层析介质

蛋白质层析技术

蛋白分离纯化平台

及单抗的分离纯化蛋白质层析介质

蛋白质层析技术

2蛋白质层析的原理和要点蛋白质层析的原理和要点3层析的概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰层析的概念流动相固定相123洗脱峰4层析一般地是一种物理方法层析的热力学分析：分配;吸附等温线；吸附脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程层析的动力学分析：塔板理论（板高方程）层析是最强有力的分离手段层析一般地是一种物理方法层析的热力学分析：分配;吸附等温线5液相层析生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术（Biotechnology）液相层析是生物大分子分离纯化的最重要手段液相层析生化分离技术，基因工程技术和免疫学技术并称为生物技术6蛋白液相层析的应用已知和未知蛋白质的纯化结构、动力学、药物作用靶点研究对高纯蛋白的需要免疫学研究及酶免检测抗体抗原的制备基因工程药物生产基因治疗对大量质粒的需要蛋白液相层析的应用已知和未知蛋白质的纯化7蛋白液相层析的构成分析型层析柱和制备型层析柱分析层析：上样量在吸附等温线的前至中段的线性范围中，可以快速定量分析样品，建立纯化方法制备层析：上样量在吸附等温线的中至后段的非线性范围中，不同组分间的相互作用不可忽略，大量纯化样品获得蛋白产物层析仪蛋白分析和纯化实现的设备蛋白液相层析的构成分析型层析柱和制备型层析柱8蛋白液相层析的一般程序样品处理选择分离机制建立初步纯化流程流程优化放大Polishing(精细纯化)蛋白液相层析的一般程序样品处理9样品制备一般性处理去处颗粒物——5µm、2µm、0.45µm分级过滤，0.2µm除菌蛋白样品的富集和浓缩脱气纯化过程中样品处理脱盐和缓冲液交换去污剂的去除离子污染物的去除其它的处理和浓缩样品制备一般性处理10分离纯化机制ChargedGroups

(asp,glu,lys,arg,his)IonExchangeandChromatofocusing

HydroxyapatiteElectrostaticCoordinationcomplexes-Repulsion-Geometricchargedistribution-SizeandShapeGelFiltration

BindingSiteBiospecificAffinityChromatographyHydrophobicRegion

(phe,trp,ile,leu,val,gly,ala,tyr)

HydrophobicInteractionChromatography(HIC)ThiolGroups

(cys)CovalentChromatography分离纯化机制ChargedGroupsHydroxyap11蛋白质层析介质基体

须具备的特性生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的.pH,络合物,巯基化合物…必要的机械性能:流体中的耐压性蛋白质层析介质基体

须具备的特性生物兼容性：亲水性，大孔径.12结构:典型层析介质的放大观察下图:2%agarosegel白线段:500nm右图:SephacrylS-500

右上:白线段10um右下:白线段0.5um结构:典型层析介质的放大观察下图:2%agarosegel13化学组成:亲水多孔高聚物等天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物孔径分布宽,较软合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类无机化合物:硅胶,羟基磷灰石,氧化锆化学组成:亲水多孔高聚物等天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖14聚合物基体(matrix)孔的结构孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析聚合物基体(matrix)孔的结构孔径分布:分配层析要求分布15孔的结构可分为三种类型标志产品:SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS孔的结构可分为三种类型标志产品:SepharoseHP，16基体孔结构决定传质特点孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反基体孔结构决定传质特点孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩17动态载量（DynamicCapacity）动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标动态载量（DynamicCapacity）动态载量是制备层18层析介质颗粒度与动态载量小颗粒传质更迅速，动态载量更高IgG1在不同颗粒度的Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较Buffer-0.05MMES,pH6.5;Flowrate:600cm/hr层析介质颗粒度与动态载量小颗粒传质更迅速，动态载量更高19吸附动力学与动态载量长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关吸附动力学与动态载量长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作20从动态载量看上样条件BSA在阴离子交换介质上的动态载量：吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感从动态载量看上样条件BSA在阴离子交换介质上的动态载量：21吸附蛋白的大小与动态载量层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感吸附蛋白的大小与动态载量层析介质表面吸附功能基团的密度大大超22柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.在多孔颗粒介质的柱子中带宽或柱效表示为：

H=2

d+B/V+Cmd2V+Csd2Vd=层析介质离子直径=填充不规则因子H=Plateheight塔板高度或柱效A=Eddydiffusion涡流扩散B=Longitudinalmoleculardiffusion径向扩散(可忽略)Cm=non-equilibriummasstransferinthemobilephase流动相非平衡物质转移Cs=non-equilibriummasstransferinthestationaryphase固定相非平衡物质转移（显著影响）V=Eluentvelocity洗脱速度影响分辨率的因素柱效依赖于层析介质对样品的选择性和分离带宽.d=层析介质离子23柱效(H)vs流速(V)

HV(flowrate)eddydiffusion

longitudinaldiffusionNon-equilibriummasstransferResultingchromatographicbehavior

柱效(H)vs流速(V)HV(flowrate)24塔板高度分辩率塔板高度分辩率25不同吸附机制的洗脱峰宽与流速BSA在同样尺寸层析柱,同样基质颗粒度,同样上样量结论:影响峰宽的因素还有溶液粘度,洗脱动力学;在其它相同的情况下,离子交换层析比疏水层析的分辩率要高一些不同吸附机制的洗脱峰宽与流速BSA在同样尺寸层析柱,同样基质261)Thyroglobulin2)Gamma-globulin3)Beta-globulin4)CytochromeC50-100µm UNOsphere30-60µm Macro-Prep5020-40µm Macro-prep2510µm Bio-Scale UNO 选用高分辨率预装柱进行分析和工艺优化，然后逐级放大1)Thyroglobulin2)Gamma-glob27分析5-10µmbeads1-20mlcolumnsHighoperatingpressures,(>80psi)半制备20-30µmbeads20-500mlMediumoperatingpressures(30-100psi)制备型层析40-200µmbeads20ml-1000litersLowtomediumoperatingpressures(5-50psi)规模：分析还是制备？分析规模：分析还是制备？28分离机制选用策略IEXHICHydroxyapatiteAffinitySECAmmoniumsulfateHICHydroxyapatiteAffinitySECHICHydroxyapatiteIEXAffinitySEC各种机制交替试用、相互衔接、补充分离机制选用策略IEXHICHydroxyapatiteAf29分步洗脱还是梯度洗脱？分步洗脱还是梯度洗脱？30几步完成纯化？几步完成纯化？31综合考虑样品的各种性质ProductPropertiesStabilityChargeatdifferentpHHydrophobicityMolecularSizeEssentialco-factorsFeedPropertiesCriticalimpuritiesProductconcentrationIntroducedcontaminantsFinalProductspecificationsPurityCostperunitLotsize综合考虑样品的各种性质ProductPropertiesF32设计合理的方案SeparationChemistry MethodScoutingChemicalStability(lifetime,hygiene)ProductivityPurity,FinalScale,EconomicsChromatographymediawithrequiredprocessperformanceBaseMatrixBeadSize设计合理的方案SeparationChemistry Me33IgG样品中蛋白酶的降解作用目标产物IgG中残存蛋白酶的降解作用对pH有很强的依赖性蛋白酶作用量:用每克IgG中被消化的IgG的毫克数来表示IgG样品中蛋白酶的降解作用目标产物IgG中残存蛋白酶的降解34阳离子交换与DNA污染某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小鼠IgM阴影为测得的IgM折线表示的DNA含量范围10exp610exp10阳离子交换与DNA污染某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小35同样的起始样品不同的纯化方案R:含目标IgM的起始粗提物方案A:两步离子交换最后一步低离子强度下分子排阻方案B:疏水层析,阴离子交换,最后高离子强度下分子排阻同样的起始样品不同的纯化方案R:含目标IgM的起始粗提物36生物大分子液相层析仪生物大分子液相层析仪37蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求液相层析仪已是非常成熟的设备层析仪是实现蛋白分析纯化的场所蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性层析仪是实现38液相层析仪的基本结构液相层析仪的基本结构39输液泵——注射泵输液泵——注射泵40输液泵——恒压泵输液泵——恒压泵41输液泵——双柱塞泵输液泵——双柱塞泵42不同泵的输液特性单柱塞泵 输液脉冲性较大双柱塞泵，可实现均匀输送双柱塞二元梯度泵是最精密的输液装置不同泵的输液特性单柱塞泵43液相层析仪的特性对于保留值相差较大的物质的分离，最有效的方法的是梯度洗脱蛋白质液相层析使用二元梯度所谓四元梯度，仅限于小分子化合物的分析液相层析仪的特性对于保留值相差较大的物质的分离，最有效的方法44二元梯度二元梯度45四元梯度四元梯度46层析仪的核心是输液泵双元梯度可实现高压混合为了保证重现性，液相层析仪使用恒流泵用于分析应保证0.01ml/min的流速精度和梯度精度，3000psi以上的高压40ml/min的流速可运行500ml的离子交换柱，纯化量可以达到克级层析仪的核心是输液泵双元梯度可实现高压混合47更换泵头技术任何泵的流量范围都很有限更换泵头技术是扩大流量范围的最优性价比的方案该技术在Bio-RadDuoFlow蛋白层析仪上实现泵的消耗费用很低，只需更换密封垫圈F10F40更换泵头技术任何泵的流量范围都很有限F10F4048单柱塞单泵低压混合——Waters650系列双柱塞单泵低压混合——BioCAD单柱塞双泵高压混合——Gilson，Beckman双柱塞双泵高压混合——HP,Bio-Rad,APBAKTA泵决定了层析仪的特性单柱塞单泵低压混合——Waters650系列泵决定了层析仪49检测器蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机会较少，而电导检测必不可少（2M(NH4)2SO4~230ms/cm）其它如pH检测器、折光检测器、荧光检测器、液质联用检测器的消耗费用是层析仪中最昂贵的（灯的更换、光栅的维护）检测器蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机会50目前常见的几种检测器三波长检测器电导检测器UV/PH/电导检测器AKTADuoFLow检测器UV检测器PH检测器四波长检测器高集成度的仪器有利于减少扩散，提高性能目前常见的几种检测器三波长检测器电导检测器UV/PH/电导检51分部收集器分部收集器52多种收集架可供选择BioFracFractionCollectorOptionalRack多种收集架可供选择BioFracFractionColl53用各种阀提高自动化程度Make-before-break高压阀AVR7-3高压上样阀AVR9-8高压阀，溶液转向各种低压阀SV5-4低压阀，缓冲液选择SVT3-2低压阀，溶液选择 或转向灵活应用各种阀和辅助泵构建随意层析系统用各种阀提高自动化程度54软件功能——控制硬件、编程控制分析纯化过程、数据分析和管理、用户管理友好程度——直观、易学易用软件功能——控制硬件、编程控制分析纯化过程、数据分析和55蛋白质层析技术ppt课件56蛋白质层析技术ppt课件57蛋白质层析技术ppt课件58蛋白质层析技术ppt课件59

TraceCompareOverlay TraceCompareOverlay60几种蛋白层析仪的综合比较ListPricePerformance高集成、模块化、高灵活性是仪器先进性的体现和发展趋势几种蛋白层析仪的综合比较ListPricePerforma61有关蛋白层析仪的几种错误观念蛋白层析与HPLC(不锈钢材质，耐强有机溶剂，不耐酸，Cl-

，EDTA等螯合离子，盐等蛋白纯化试剂）。层析柱或层析介质是层析分离实现的场所，现代蛋白液性层析仪兼容所有蛋白层析介质，不存在所谓“有利发挥介质特性的层析仪”。工艺移植和同一介质的不同粒度有关，一般和仪器无关，除非仪器集成度不高，死体积太大。很多功能是竞争的产物，非必要，更非业界标准。有关蛋白层析仪的几种错误观念蛋白层析与HPLC(不锈钢材质，62蛋白质纯化平台分子生物学实验室的层析姜韬蛋白质纯化平台分子生物学实验室的层析63引言现代生物学研究的发展，为分子生物学实验带来新的课题和挑战。目标ＤＮＡ的功能研究其中相当的工作需要分离纯化表达了的基因产物－目的蛋白。研究其活性并制备抗体进行更深入的功能探讨。生物技术的发展，特别是以液相层析为核心的生化分离技术的日益成熟和完善为分子生物学实验室提供了这种充分的条件。

引言现代生物学研究的发展，为分子生物学实验带来新的课题和挑战64生物技术(Biotechnology)有三大部分：生化分离技术；DNA重组及基因转移技术；免疫检测技术。其中生化分离技术是生物技术的基础和支柱。层析(chromatography)是最有效的分离手段，也是最重要的蛋白质纯化工具。层析主要是物理方法，是混合熵减少的过程，必然消耗自由能。基因工程下游的核心是层析。层析技术的理论与实践已高度发展和完善。生物技术(Biotechnology)有三大部分：生化分离技65蛋白质纯化平台将成为分子生物学实验室的基本内容分子生物学家运用的分离纯化技术具有平台的特征蛋白质纯化平台将成为分子生物学实验室的基本内容分子生物学家运66生化学家分离未知蛋白规模较小，目标蛋白含量往往极低；各步骤用活性分析和蛋白分析严密监控；针对性强，过程复杂，不可移植；产物纯度要求高，往往用于测序。生化学家分离未知蛋白规模较小，目标蛋白含量往往极低；67基因工程下游分离已知蛋白

规模较大，目标产物含量较高；重视纯化过程的技术经济指标；有较强的针对性，移植性很差；产物纯度要求高，通常有特殊要求：无病毒，无DNA，无内毒素。

基因工程下游分离已知蛋白规模较大，目标产物含量较高；68分子生物学实验室需分离已知蛋白规模小；目标蛋白含量较高，往往是高表达的产物，往往大于5%；纯度和回收率往往要求较低，电泳纯；步骤少，硬件结构有通用性。

分子生物学实验室需分离已知蛋白规模小；69

蛋白质纯化平台的结构和组成

含量较高的蛋白质纯化，基本可以在三个层析步骤中实现。利用目标蛋白的三个独立的物理化学性质进行层析分离。蛋白质纯化平台的结构和组成含量较高的蛋白质纯化，基本可以70分离机制分子的大小凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子排阻）分子的电性离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换分子的表面疏水结构疏水层析（HIC）其它：羟基磷灰石，反相，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析精制（polishing）：高分辨率层析

分离机制分子的大小凝胶过滤(size-exclus71纯化平台的硬件结构

中心设备：中压至高压层析仪辅助设备：过滤装置，超滤装置，离心机，蛋白质电泳等纯化平台的硬件结构中心设备：中压至高压层析仪72层析柱不同性能的层析柱；层析柱装填：（1）均匀；（2）紧密柱效评价：理论塔板板高

不同粒度近似关系为：H

dp2在装填良好的情况下，通常：凝胶过滤H

2dp；离子交换、疏水H

3dp

层析柱不同性能的层析柱；73经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当2倍的蛋白质完全分开；6000个理论塔板可分开相差1.5倍分子量的蛋白。通常，3000个塔板如用Bio-GelP(fine)或Bio-GelA(fine)，流速<20cm/h（参照产品说明书）应在80cm以上至120cm，上样<5%，一般1-2%。Scope建议：柱直径：D=(M/10)1/3

D:cm；M:蛋白量（mg） 而L=30DL：cm经验：具有3000个理论塔板的凝胶过滤可近似地将分子量相当274实验室规模的层析应采用不大于50

m的离子交换或疏水介质，应具有10cm左右，则不少于600个理论塔板。精制：高效预装柱1-5ml，10

m左右粒度，如Mono系列；Bio-Scale；TSK等。实验室规模的层析应采用不大于50m的离子交换或疏水介质，应75平台的操作（软件：知识结构）

样品处理及准备工作用SDS监测整个流程富含目标蛋白的提取物的获得：应采用尽量低强度的抽提方法。通常PBS或TBS抽提能力过强，没有必要.低渗更有利于破碎，甚至可用水进行抽提（如1：4左右）。无特殊理由，pH应准确控制在中性附近，尽量用酸性buffer；最好运用（NH4）2SO4沉淀，缩小体积，便于保存。终止生化代谢反应，除糖、脂类。个别情形中会造成不可逆沉淀；平台的操作（软件：知识结构）样品处理及准备工作76E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要使用超声破碎法。0

C，20%蔗糖，10mM左右缓冲液，含2.5mMEDTA高渗后，加入低渗液，迅速充分悬浮。如果必要，应含DTT至2mM左右。均浆液组成原则：离子强度尽量低：

50mM，有时需DTT，不一定加EDTA，可考虑加PMSF，但此时不宜用Tris等胺类缓冲剂。E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因不要77样品通常特点及对后续纯化的影响大多数蛋白将带负电荷，样品会含一定量核酸；（NH4）2SO4沉淀，通常蛋白浓度1-５mg/ml；运行层析，则蛋白浓度不应大于１０mg/ml。样品通常特点及对后续纯化的影响大多数蛋白将带负电荷，样品会含78通常纯化流程：选择性、分辨率、载量目标蛋白为碱性蛋白，在中性附近运用阳离子交换，选择性好，除核酸多糖；目标蛋白为酸性蛋白，则第一步层析采用分子筛，最好此前将溶液脱盐，并在含０.２-０.４MNaCl的缓冲液中运行，缓冲成分视下一步而定。如果介质含聚丙烯酰胺，则应含Tris等含氮的缓冲成分，减少

-

互相作用造成的吸附.通常纯化流程：选择性、分辨率、载量目标蛋白为碱性蛋白，在中性79离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换步骤（BufferExchange）；如有必要，浓缩后，BufferExchange，进行精制。离子交换：平衡液应采用尽量低的离子强度，上样体积不限。离子交换后，采用疏水层析，可省去缓冲液交换步骤（Buffer80pH：阳离子通常低于pI一个pH单位阴离子通常高于pI一个pH单位Stickyprotein：在某pH附近，与阳离子和阴离子层析介质都结合。参数获得

２.５％上样体积运行离子交换及疏水，样品不需平衡。pH：阳离子通常低于pI一个pH单位81实例及分析从阳离子交换入手──凝胶过滤，疏水从凝胶过滤入手──疏水，离子交换亲和层析不一定必要实例及分析从阳离子交换入手──凝胶过滤，疏水82从凝胶过滤入手──离子交换hpag4蛋白分子量约180kD，pI约5，粗提物中含量约5%；粗提物主要特性：I约0.05；pH约7.3；蛋白含量20mg/ml，含少量RNA和endotoxin。从凝胶过滤入手──离子交换hpag4蛋白分子量约180k83Size-exclusionSampleformat:desolved50%(NH4)2SO4precipitatePurificationfactor:8.8Size-exclusionSampleformat:d84AnionexchangeSampleformat:ultrfiltrationconcentratedanddesultedtargetfractionPurificationfactor:2.9AnionexchangeSampleformat:85从阳离子交换入手

──凝胶过滤，疏水从阳离子交换入手

──凝胶过滤，疏水86CationExchangeSampleformat:

的olvedanddesulted50%(NH4)2SO4precipitatePurificationfactor:13CationExchangeSampleformat87SizeExclusionPurificationfactor:2.4SizeExclusionPurificationfac88

Purificationfactor:1.3Purificationfactor:1.389PolishingPolishing90

FABPFABP91蛋白质层析技术ppt课件92蛋白质层析技术ppt课件93AffinitychromatographymaybenotnecessaryAffinitychromatographymaybe94GSTformsmultipeaksSampleformat:desultedtargetfractionofformerstepGSTformsmultipeaksSamplefor95Sampleformat:desulted40-80%(NH4)2SO4(with2mMDTT)fraction

Sampleformat:desulted40-80%96NativeGSTisdominantSampleformat:desultedtargetfractionofformerstepNativeGSTisdominantSamplef97致谢博士生杨领海参与全部实验工作，并引用其论文部分结果。任金琪同学参与部分工作。致谢博士生杨领海参与全部实验工作，并引用其论文部分结果。98

单克隆抗体的纯化（纲要）姜韬单克隆抗体的纯化（纲要）姜韬99

单克隆抗体的生产是最大的生物工程行业，也是制备规模的层析技术最大的使用行业。

单克隆抗体的生产是最大的生物工程行业，也是制备规模的层析技100单克隆抗体的生产已成为相当成熟的行业（FDA认证）

上游：（小鼠）杂交瘤的制备，筛选，培养及生产已非常完善。含血清培养基无血清培养基下游：单克隆抗体纯化平台已实现—无论单抗是否产生于含血清的培养基，都可在两步层析后得到足够纯度和活性回收，但效益不同。单克隆抗体的生产已成为相当成熟的行业（FDA认证）上游：（101抗体分子的三维结构已测定抗体分子的三维结构已测定102抗体分子是较大的球蛋白抗体分子是较大的球蛋白103单克隆抗体纯化的必要知识及理论准备已很充分抗体的分子结构和重要理化特性已很清楚抗体分子大小：IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等。抗体的电性：以pI为弱碱为多。抗体的疏水性：血清中最疏水的蛋白质种类之一.特异亲和性：对抗原、ProteinA和ProteinG等.对金属离子的强螯和性：IgG类。溶解性：如低离子强度下的低溶解度(Euglobulin)：IgM类。其他特性：如不同pH下稳定性；又如Cryoglobulin：2%IgG、20%IgM。单克隆抗体纯化的必要知识及理论准备已很充分抗体的分子结构和重104沉淀法的应用

盐析:(NH4)2SO4,K2HPO4,Na2SO4,citrate.正辛酸（octanoicacid）沉淀杂蛋白，对高pI的单抗效果更好。PEG沉淀。Ethacridine沉淀杂蛋白，对高pI的单抗效果更好。低盐沉淀:仅限于IgM类。沉淀法的应用盐析:(NH4)2SO4,K2HPO4,Na2105分子排阻层析

分离选择性有限，通常限于IgM类。

分子排阻层析分离选择性有限，通常限于IgM类。106离子交换

最重要的单抗纯化工具：阳离子交换通常比阴离子交换效果更好；抗体正电性变异更大，因而是最有力的去除非特异抗体的方法。运用阳离子交换时，可采用低pH杀病毒。可能要克服的困难：阳离子交换：低pH下抗体的沉淀阴离子交换：高pH下蛋白酶的激活离子交换最重要的单抗纯化工具：阳离子交换通常比阴离子交换效107羟基磷灰石层析

效果与离子交换相当，价格较昂，特别有利于去除DNA，Endotoxin和病毒。但最好先去除Albumin.通常以pH6.0-6.5上样。

羟基磷灰石层析效果与离子交换相当，价格较昂，特别有利于去除108羟基磷灰石的独特选择性羟基磷灰石的独特选择性在于：载体基质表面的钙对蛋白质表面的相近羧基的络合作用这种络合作用在pH6.2附近最大羟基磷灰石的独特选择性羟基磷灰石的独特选择性在于：载体基质表109磷酸盐是强有力的洗脱剂BSA在不同pH的Good’sBuffer上样,洗脱的分析洗脱液中磷酸根的络合性和离子交换性都有贡献磷酸盐是强有力的洗脱剂BSA在不同pH的Good’sBuf110上样液中要避免含磷酸盐IgG在不同磷酸浓度下上样的动态载量pH6.8上样液中要避免含磷酸盐IgG在不同磷酸浓度下上样的动态载量111可在较高离子强度下上样上样:IgG10mg/ml,50mMMES,pH6.5,不同浓度NaCl可在较高离子强度下上样上样:IgG10mg/ml,50m112在pH6.5的MES中有很高的载量陶瓷型羟基磷灰石具有优良的动态载量在pH6.5的MES中有很高的载量陶瓷型羟基磷灰石具有优良113典型分离层析结果含单抗IgG腹水水样品在陶瓷型羟基磷灰石柱上的分析结果抗体可以与Transferrin完全分离,与Albumin分离良好典型分离层析结果含单抗IgG腹水水样品在陶瓷型羟基磷灰石柱上114疏水相互作用层析

须采用疏水性很弱的配基；效果很好，完全除去Albumin及Transferrin，去除DNA效果优于离子交换；抗体通常在最后被洗脱，载量高。疏水相互作用层析须采用疏水性很弱的配基；115金属螯合柱层析

依赖IgG上的HisCluster，效果很好；是条件最温和的吸附层析，最有利于活性保持；要防止金属离子的泄漏。金属螯合柱层析依赖IgG上的HisCluster，效果很116ProteinA和ProteinG层析

主要依赖IgG上的HisCluster；单步纯化效果很好；抗体构象变化可能较严重；要解决配基的泄漏。ProteinA和ProteinG层析主要依赖IgG上117特殊高选择性介质

如thiophilicadsorptionchromatography：采用含硫和吡啶的配基；主要问题：疏