DB36T 1799-2023 茶树菇菌种鉴定技术规程

ICS65.020.20CCSB30

DB36发布发布江西省市场监督管理局2024010120230701江 西 省 地 方 标 准DB36/T1799—2023茶树菇菌种鉴定技术规程TechnicalregulationsofidentificationforCyclocybeaegeritaspawnDB36/T1799DB36/T1799—2023DB36/T1799DB36/T1799—2023II目  次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1试剂和仪器 2鉴定方法 2附录A（规范性）培养基制备 7附录B（规范性）试剂及其制备 8附录C（资料性）仪器 11附录D（规范性）拮抗反应类型 12附录E（资料性）试验用引物参照 13IIII前  言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院农业应用微生物研究所、江西省农业技术推广中心。本文件主要起草人：王洪秀、魏云辉、龚正、胡佳、冯艳、孙鹏、陈绪涛、袁梦涵。茶树菇菌种鉴定技术规程范围本文件规定了茶树菇菌种鉴定的过程，包括试剂和仪器、样品制备、试验步骤、试验数据处理等内容。本文件适用于江西省茶树菇菌种鉴定。规范性引用文件NY/T1097食用菌菌种真实性鉴定酯酶同工酶电泳法NY/T1730食用菌菌种真实性鉴定ISSR法NY/T1845食用菌菌种区别性鉴定拮抗反应术语和定义NY/T1845、NY/T1097和NY/T1730界定的以及下列术语和定义适用于本文件。茶树菇Cyclocybeaegerita茶树菇Cyclocybeaegerita隶属于真菌界FungiKingdom、担子菌门Basidiomycota、伞菌纲AgaricomycetesAgaricomycetidaeAgaricalesTubariaceaeCyclocybe，菌种区别性distinctnessofspawn供检菌种和对照菌种的不符合性。[NY/T1845，定义3.1]隆起型ridgy对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处菌丝隆起。1[NY/T1845，定义3.2]沟壑型chimb色线型colorbar对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界处形成一条色素分界线。隔离型dividingline对峙培养的茶树菇菌株间拮抗表现特征之一，表现为两菌株菌落交界出现一条无菌丝的带状分隔区。菌种真实性genuinenessofspawn供检菌种和对照菌种的符合性。[NY/T1097，定义3.1]对峙培养法face-offculture酯酶同工酶法esteraseisoenzymemethodISSR法intersimplesequencerepeattechnique以锚定微卫星DNA为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，得到与锚定引物互补的重复序列的区间DNA片段。不同物种基因组DNA中的这种反相重复的微卫星序列的数目和间隔的长短不同，就可导致PCRPCR产物的检测和比较，即可识别茶树菇菌种基因组DNA的多态片段，从而鉴定菌种的真实性。233在通风、避光、温度为25℃条件下培养至接种块菌丝接触，需20d～25d。5.1.5 判定规则D。酯酶同工酶法液体培养直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25℃，180rpm振荡避光培养20d。培养基的制备参见附录A.2。酯酶同工酶样品制备3份。称取菌丝体0.5g于1.5mL离心管中，放入冷冻干燥机中低温冷冻干燥24h。向每个装样品的离心管中加入小钢珠并将离心管放入组织研磨仪中，60Hz下研磨30s成细粉末，加入0.5mL样品提取液（附录B.1）。将研磨后的样品在4℃下1200010比例混匀，混合液即为电泳样品。5.2.3 凝胶制备试剂和仪器培养基制备及试剂要求按照附录A和附录B执行，仪器按照附录C准备。鉴定方法对峙培养法菌丝体培养供检茶树菇菌株与对照菌株在相同条件下培养，将固体菌种从试管斜面接种到直径90mm固体PDA平板上，25℃避光培养15d。接种组合与重复次数茶树菇供检菌株与对照菌株的拮抗反应接种组合为33接种操作严格按无菌操作，用单孔直径5mm打孔器分别打取活化后适龄的茶树菇供检菌株与对照菌株菌落边缘做接种块，菌丝朝上，两接种块间隔30mm，置于平板中心位置。培养条件分离胶分离胶浓度7.5%（B.3）:（B.5）:双蒸水:（附B.2）=2:5:1:80.1%的cm，加入适量的水封住胶面，待凝胶聚合后将水吸出。浓缩胶浓缩胶浓度（（双蒸水:（附录B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀，灌入胶室，立即插入样品梳，待凝胶。点样（附15μL～20μL样品加入点样孔。电泳将电泳槽放入冰箱内进行低温电泳，采用稳压电泳，电压为130V，待指示剂进入分离胶后，电压升至260V。待前沿指示剂距胶底部约1cm～1.5cm，停止电泳。取胶染色（附录℃1520min，用水冲洗干净后置乙酸溶液（B.10）中固定。迁移率Rf值计算应按照NY/T1097的规定执行。判定规则ISSRDNA模板的制备30.2g30.5g1.5mL24h。向每个装样品的离心管中加入小钢珠并将离心管放入组织研磨仪中，60Hz30s成细650μL656540min～60不时轻轻地摇动混匀。12000rpm10min1.5mL离心管中，弃沉淀。4加入等体积的酚-氯仿-（附录℃rpm151.5mL离心管中，弃下层有机相。加入等体积的氯仿（附录B.15）℃，12000rpm15min1.5mL离心管中，弃下层有机相。260min，10000rpm10min，弃上清液。70%（2DNA。100μLTE（附录2μL℃812h。DNATE（B.18）300μL5MNaCl（附录B.19）50μL，CTAB纯化缓冲液（附录B.14）40μL，65℃10min。3.6.2.43.6.2.53.6.2.6DNA，-20℃复冻融使用。DNA质量的检测凝胶电泳检测凝胶成像5μL1μL0.8%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。筛选判定与DNA分子量标记比较，观察所提取的基因组DNA质量及片段大小，按下列标准判定：DNA样品，可用于鉴定；DNA样品，不建议用于鉴定；DNA样品，不可用于鉴定。A260/A280OD值检测DNA1μLDNAA260/A280的ODOD260值相当于50μg/mLDNADNADNAOD260/OD2801.7～2.0之间。依据测得的质量浓度将DNA溶液稀释到25ng/μL～50ng/μL，-20℃保存。ISSR扩增引物引物见附录E。如果必要可以筛选新的引物。反应体系566观察空白对照的凝胶成像照片，按下列结果判断：3个平行试验结果一致，则本次试验结果可以使用；PCR空白对照中扩增出了片段，则说明检测过程中发生了污染，需查找原因重新检测。5.3.7 判定规则PCR1，可判PCR产物一致，再增加引物个数，进行检测验证。必要时可以增加其他方法佐证。PCR202PCRPremix10μLPrimer10μmol/L1μLDNA1μLddH2O8μL0.2mLPCRPCR扩增。设置PCR空白对照。反应条件PCR扩增仪上进行以下循环：943min9430s，55℃45s，72延伸2min，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳检测（1.8%50℃～60℃缓冲液（附录B.21）的电泳槽中。PCRDNA分子量标记，接5V/cm1cm左右停止电泳。数据记录电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。PCR扩增产物质量判断77附录A（规范性）培养基制备固体培养基（PDA）：马铃薯200g（用浸出汁），葡萄糖20g，琼脂20g，去离子水或相当纯度的水1000mL，pH自然。液体培养基（PDB）：200g新鲜马铃薯，20g葡萄糖，加去离子水或相当纯度的水补齐至1000mL，pH自然。100mL三角瓶装50mL左右。886.0g28.8g1L，使用时稀释10倍，使用液pH8.3。B.8 磷酸缓冲液10.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃贮存。B.7 酯酶同工酶电极缓冲液28.0g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定容至100mL，用棕色瓶4℃贮存。B.6 浓缩胶母液5.98g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）48mL1mol/LHCL溶解，TEMED0.46mL，定容至100mL，4℃贮存。B.5 分离胶母液B.4 浓缩胶缓冲液（pH6.7）附录B（规范性）除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。样品提取液（pH7.5）6.02g（Na2HPO4·12H2O）0.50g（NaH2PO4·2H2O）100mL。过硫酸铵(1.4g/L)称取0.14g过硫酸铵溶于水中，定容至100mL，现用现配。分离胶缓冲液（pH8.9）36.3g48mL1mol/LHCL0.23mL，100mL，4℃贮存。9970mL100mL。25:24:1的体积比进行配制，4℃B.17 70 乙醇溶液24:14℃B.16 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）4.1gNaCl80ml10gCTAB，55℃100mlB.15 氯仿-异戊醇（24:1）16.364g70mL4g溴代十六烷基三甲胺（CTAB），完全溶20mL1mol/LTris-HCl(pH8.0)8mL0.5mol/LEDTApH1000.1%的β-巯基乙醇。B.14 CTAB37.22g（EDTA-Na·2H2O）160mLNaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至200mL，高压灭菌。B.13 2 CTAB22.6g（Na2HPO4·12H2O）21.4g（NaH2PO4·2H2O）1L。酯酶同工酶染色液0.1g乙酸-1-萘酯、0.1g乙酸-2-萘酯、0.2gRR10mL丙酮溶解，再加入磷酸缓300mL，过滤，现用现配。乙酸溶液70mL/L。量取14mL乙酸，加到适量水中，并稀释至200mL。1mol/LTris-HCl(pH8.0)12.11g80mLpH8.0100mL，高压灭菌。B.12 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液(pH8.0)1010B.26 无水乙醇B.25 DNADNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂。B.24 核酸染料4×ProteinNativePAGELoadingBuffer。B.23 PCRPremixTE在80mL水中依次加入1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL，加水定容至100mL，高压灭菌。5MNaCl称取292.5gNaCl，溶解于水中，稀释到1L。50×TAETris242.2g300mL100mL0.5mol/LEDTA的水溶解(pH8.0)，pH8.01L。1×TAE取20mL50×TAE，ddH2O定容至1L。室温保存。酯酶同工酶上样缓冲液1111LED观片灯微量进样器C.15 凝胶成像系统C.14 稳压稳流电泳仪PCR扩增仪水平板电泳槽垂直板电泳槽：凝胶面积（W×L）160×180mm电热恒温水浴槽：精度±0.1微量核酸检测仪附录C（资料性）仪器生化恒温培养箱：精度±0.1分析天平：感量0.01g、0.0001g各一台打孔器：单孔直径5mm高压灭菌锅冷冻干燥机组织研磨仪高速冷冻离心机（10000rpm以上）全温摇瓶柜：精度±0.1附录D（规范性）A BD EＡ：隆起型；Ｂ：沟型；Ｃ：隔离型；D：色线型；E：箭头所示菌株间无拮抗121313附录E（资料性）表E.1