抗菌抗病毒常用实验研究方法知识

抗菌抗病毒常用实验研究方法细菌病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染尤其是近两年由冠状病毒引起的SA由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害是人所共知的由于各种疫苗的不断出现虽然一些细菌病毒病已得到了有效的控制但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。、常用的抗菌方法、稀释法、、试管稀释法培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌经孵育后观察能引起抑菌作用最低抗生素浓度称最低抑菌浓度(M菌对药物的敏感度。稀释法所获得的结果比较准确常被用作校正其他方法的标准如以下黄贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方:1]、应用试管稀释法测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果检验不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。结果青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用不明显[。1]、采用试管稀释法分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚部分醇提乙酸乙酯部分醇提正丁醇部分醇提水溶部分等种提取物对大肠杆菌C83、大肠杆菌C83、大肠杆菌C83、沙门氏菌C79、20菌Newboul、球菌临床分离株等最低抑菌浓度(M低杀菌浓度(M验结果表明火绒草醇提物及其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用其MIC0114生药浓度,M为0127浓度而其它部分对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对株大肠杆菌和株沙2]门氏菌具有较强的抑制作用其MC2170生药浓度,M为2170mg/ml生药浓度显示了较强的抗菌活性[。2]、、肉汤稀释法以水解酪蛋白(M培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(M低杀菌浓度(MC)3]如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MR的体内不同的部分产物利用肉汤稀释法测定其对MR和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MS的最低抑菌浓度(MI内验部分:采用腹腔注射MRSA立小鼠感染模型分别给予蓝玉簪龙胆水提液高中低剂量胶疗15，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验:蓝玉簪龙胆各极性组分对MRSAMSSA均有不同程度的抑菌作用其中正丁醇组分抑菌作用最强其次为乙醇水层组分;体内试验:除了蓝玉簪龙胆大剂量组其余各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论蓝玉簪龙胆对MR和AMS均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性;对MR染小鼠有一定治疗作用[。胡景玉等为了了解衡水地区大肠埃希菌的药3]50050 04][5]敏情况，采用肉汤稀释法1种抗菌药物最低抑菌浓度（M并计算其MI和MI。结果亚胺培南、哌拉西林、他唑巴坦和头孢哌酮、舒巴坦显示良好的抗菌作用，其MI分别为0.μg/、lμgm、0.μgm；MI均为2μg/，l，产ES出率较高。结论检出、舒巴坦普遍敏感[。Kianba等通过肉汤稀释法研究刺蒺藜不同部位（果、菌AT92粪肠球菌AT922肠埃希氏菌ATCC259菌ATCC的抗菌能力，研究结果的MIC均为2mg；根的甲醇提取物对MIC对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肠埃希氏菌均为4mg，对绿脓杆菌的MI50050 04][5]1、1、琼脂平板稀释法将不同浓度的抗菌药物，分别加入到定量的琼脂培养基中，混匀，制成固体含药平皿使每一个平皿中所含抗菌药物的浓度相差倍用多点接种仪把待测细菌点种到含有抗菌药物的琼脂培养基的表面上在特定温度下培养适当时间后，平皿上无菌落生长的最低药物浓度为抗菌药物对受试菌种的最低抑菌浓度。每一次实验都应用标准菌株做质控琼脂平板稀释法本法的特点是可同时进行大量菌株的药敏测定。也适用于中草药和厌氧菌的药敏测定。6]如汪黎虹等应用超微粉碎法将虎杖、石榴皮、马齿苋、苦楝皮、大黄等10种中药进行加工处理至粒径为5~10后利用琼脂稀释法测定其实验室近年来收集的患病鳗鲡中分离得到的18株常见致病菌的抑菌作用结果表明:上述10种中药单用对除B1肺炎克雷伯菌以外的1株养殖鳗鲡主要致病菌均有一定的抑制作用，其平均抑菌浓度(M为0.165~128，平均杀菌浓度(MBC)为0.210~128[。g/m6]1、1、浓度梯度法浓度梯度试验是一种定量的抗生素药敏测定技术，可用于非苛养革兰阳性和阴性需氧菌如肠杆菌假单胞菌葡萄球菌和肠球菌以及苛养菌如厌氧菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌的药敏测定。该系统包含有一个预先制备好的抗生素浓度梯度，可用于在琼脂培养基判断某抗生素对微生物的最小抑菌浓度(M)刘芳等的武汉地区住院患儿感染肺炎链球菌的耐药状况。2[7]如刘芳等的收集医院200年1-1月住院患儿分离的肺炎链球菌151,采用纸片扩散法及E-t法进行抗菌药物敏感试验按CLSI年0判断结果；使用检验分析耐药性的变化研究结论为武汉地区住院患儿分离的肺炎链球菌对红霉素克林霉素四环素及磺胺甲噁唑甲氧苄啶的敏感率极,对左氧氟沙星及万古霉素均有极高的敏感率,对青霉素仍保持较高的敏感率,可作为治疗普通肺炎链球菌感染的首选药物2[7]81、1、5试管两倍稀释法试管两倍稀释法取生长浊度达9×10mg，菌液用培养液稀释，接种8于无菌试管中然后加入不同浓度的抗菌药物或未知药物，3℃孵育1～2，以无细菌生长的最低浓度为M将无细菌生长的完全清晰液再移种于不含抗菌经3℃过夜培养，菌落数不超个的平板的最低药物浓度即为该药物的M一般以M评价细菌对药物的敏感度。马加庆等的采用试管两倍稀释法观测利胆止痛胶囊在体外对甲型溶血性链球菌乙型溶血性链球菌金黄色葡萄球菌及痢疾杆菌大肠杆菌和沙门菌生长8]的影响．研究结果表明：利胆止痛胶囊对金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、乙型溶血性链球菌、痢疾杆菌和大肠杆菌的MIC别为25505、2和12.5mg沙门菌无明显抑菌作用[。8]、、微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法的原理原理同肉汤稀释法石功名等的对西他沙星与莫西沙星抑制细胞内外金黄色葡萄球菌ATCC行体内外研究，采用微量肉汤稀释法检测药物的MMM研究结果表明在体外实验中MMCM时间与浓度杀菌曲线实验表明西他沙星胞内外抑菌活性均强于莫西沙星。[9]。、、微量稀释法微量稀释法本法为改进的试管稀释法。取稀释菌液接种在9孔板中，然后加入待试抗菌药物，混匀后放置37孵育1～24，h衬有黑底板的光线下观察细菌生长时小孔呈弥散状混浊或在孔底部有圆形或丝状的沉淀无细菌生长时孔内所含最低抗菌药物浓度即为M把无细菌生长孔内液体移种不含抗菌药物血平板中，菌落数少个的平板的最低药物浓度即为MC0]如宋晓晶等通过微量稀释法分别测定特比萘芬氟康唑伊曲康唑制霉菌素对3株临床分离的口腔念珠菌的体外敏感性。研究结果表明3株白念珠菌对氟康唑耐药株,敏感3株;对伊曲康唑耐药株,敏感3株;芬耐药1株,敏感2株;制霉菌素均敏感[10]、纸片琼脂扩散法琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散其浓度随扩散距离增大而降低在药物一定的扩散距离内由于药物的抗菌效应试验菌不能生长此无菌生长的范围称为抑菌圈抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。如熊枫等的从西太平洋近赤道区采集到的1个深海沉积物样品中分离到83株海洋真菌采用滤纸片琼脂扩散法和M分别对其发酵液乙酸乙酯抽提物的抗菌、抗肿瘤活性进行筛选结果显示有3株菌株对至少一种指示菌有抑制作用有2株菌株对K或Ra瘤细胞具有显著的抑制活性分别占总供测菌株的44634.在抗肿瘤活性菌株中,WP-、DY-、WP--31]WP-株菌具有很高的活性其发酵液乙酸乙酯抽提物对Ra胞的IC50分别为5.....520明海洋沉积物来源的真菌中蕴藏着丰富的抗菌及抗肿瘤活性代谢产物产生菌是开发抗菌和抗肿瘤药物的宝贵资源[1又如邬晓勇等的建立了蛙皮抗菌肽的活性测定方法——1][12]—TTC量稀释法;利用Sepha离抗菌肽粗品获得一个活性组分命名为利用T量稀释法测定活性组分G抑制大肠杆菌的MIC是μg/制铜绿假单胞菌的MC20g/制金黄色葡萄球菌的MI是8μg/m活性组分G再经凝胶HP分离纯化获得两个活性组分Ⅰ和Ⅱ，组分Ⅰ和组分Ⅱ再分别经过RP-化获得两个色谱纯的活性组分命名为RaRn[12]、平板稀释法如吴决等的探讨抗菌性中药药物敏感试验在鉴定中药新药上的应用应用中药药敏试验平板稀释法鉴定中药新万力通对常见十余种细菌的最低抑菌浓度(MI结果运用平板稀释法测定中药新药MIC,理想结论在中药药敏试验诸方法中平板稀释法鉴定中药新药抑菌作用方法简便易操作结果易观。察[13]、打洞法。[4]5]如向红采用平板打洞法对西南委陵菜(Potens)根、叶明对G大肠杆菌、G-贺氏痢疾杆菌G+黄色葡萄球菌均有抑菌作用不同的入药部位对同一细菌的抑菌能力不同作用的强弱与药液浓度的大小有关同一入药部位对不同细菌无明显选择抑制作用再如袁婷等常见中草药的体外抑菌试验应用体外抑菌试验的平板打洞法、试管两倍稀释法和平板培养法对本地常见中草药一枝黄沙、金黄色葡萄球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度分别为1/和01/，最小杀菌浓度分别为1/21/；对肺炎链球菌、蜡状芽孢杆菌呈中度敏感，最小抑菌浓度均为1/，未见最小杀菌浓度黑老虎、土甘草均对肺炎链球菌呈高度敏感，最小抑菌浓度均为1/，最小杀菌浓度分别为1/21/0鼠伤寒沙门氏菌蜡状芽孢杆菌金黄色葡萄球菌无抑菌作用花木通则对四种供试菌均未见抑菌作[4]5]、挖沟法如武延隽等的了解巴豆油抗菌谱。方法采用琼脂挖沟法与琼脂绝对浓度法6][3,6种临床常见的病原菌和条件致病菌进行了实验室条件下巴豆油抗菌活性研究。结果琼脂绝对浓度法巴豆油在1B10对金黄色葡萄球菌有抑制生长的作用对其余1种细菌均无作用琼脂挖沟扩散法巴豆油对所有2种实验菌均无抑制生长作用。结论琼脂挖沟扩散法实验中巴豆油对所有实验菌均无抗菌活性而在琼脂绝对浓度法的实验中1B释的浓度对金黄色葡萄球菌仍有抗菌活性不同方法影响巴豆油抗菌的结果[1。、抗病毒方6]、1细胞病变法(cytopathiceffect,CPE)细菌病变法是以CP为指标方法简便能够对多数药物抑制病毒增殖的效果进行测定与评价。一般以加号表示细胞病变程度细胞病变<2为+细胞病变25%~5胞病变50%~75%,病变>75%+++。如张春江等的探讨藏药甘青乌头抗单纯疱疹病毒II（HS作用和机制。方法M测定甘青乌头对Ve细胞的毒性，采用细胞病变法和蚀斑法测定甘青乌头体外抗病毒活性以半数抑制浓度和治疗指数为评价指标定量荧光P和蚀斑法考察甘青乌头体外抗病毒作用机制用HS小鼠脑炎模型对甘青乌头体内抗单纯疱疹病毒的抗病毒活性进行评价结果甘青乌头对Vero的半数中毒浓度(CC50)L细胞病变法和蚀斑法测得甘青乌头的半数有效浓度(EC分别为2.8L治疗指数T分为2.。LD为0.k。甘青乌头延长了小鼠的平均存活时间对小鼠的死亡显示出10%护率甘青乌头能直接灭活HSV-2显著抑制HS染性对病毒吸附到细胞没有抑制作用能抑制HS2子的增值。抑制HSV-合制倍数达102论：甘青乌头体外具有较强的抗HS性，抗病毒作用是通过抑制病毒复制循环的各个环节起作用的[17]。、2染料吸收法、、1MTT法MT可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成紫色不溶性结晶颗粒并沉积在细胞内或细胞周围而死细胞则无此功能。二甲基亚砜(DM或酸化异丙醇能溶解细胞中的紫色不溶性结晶物用酶联免疫检测仪在5波长处测定其光密度值(O接反映活细胞数量在一定细胞数范围内,M晶物形成量与细胞数成正比因此可用于抗病毒药物的活性筛选。如付光发等的中药鸭拓草提取物抗病毒作用的研究。在9孔培养板单层培[18]9]养ve胞将鸭拓草提取物按照倍比关系稀释浓度分别为25.6mg/ml12.8mg/ml3.2m1.6m0.8m0.4m0.2m0.lmg/ml,每一稀释浓度都要重复次同时设正常细胞对照观察细胞病变采用MTT,在培养过48h细胞中加入含MTT养液5mgl,.0养4一6后加入二甲亚矾每孔0.l测定其在57下的吸光度将Ve胞生长呈单层孔培养板上加入100TCro5每孔加入0.lml,lh后除去病毒液加入TCS(12.0mg稀释出5个浓度的鸭拓草提取物再以4倍倍比稀释即分别为128080205vg毒对照细胞对照受试药物和阳性药物对照组用此法检测病毒抑制率按照Pro法计算IC50又如KrusePF,PattMTTon清热消炎复方制剂体外抗柯萨奇病毒(CV道合胞病毒(R方法待正常细胞长成单层用病毒感染培养一定时间后根据不同病毒感染细胞出现细胞病变(CPE)时间的不同加入一定量的M然后测定OD计算病毒抑制率结果:MTT法较光镜C更为客观能以O值变化反映药物对病毒的抑制程度从而获得实验结果且便于统计学处理。结果证明M是一种能广泛应用于抗病毒药物筛选和评价的方法[[18]9]、、2中性红染色法中性红染料吸收法的原理是活细胞能够吸收一种弱阳离子染料)性红,后者与活细胞胞浆中的阴离子结合而滞留于活细胞中并不被细胞洗涤液洗脱,渗入活细胞的中性红量与活细胞数量成正因此O值直接反映活细胞的数量,与细胞增殖的程度成正比。一般根据各组之平均O值计算抑制百分率再按ReedanenchIC50抑制百分率实验组平均O值病毒对照组平均O值细胞对照组平均OD值病毒对照组平均O值勤x100%0][1]如高川等的探讨白颖苔草粗提物对呼吸道合并胞体病毒(R型流感病毒(Fl和基病毒B3(Cox体B3)作用。方法采用超声提取获得药物粗提物以HEK29、MDCK-和HEK293染通过显微镜下观察细胞病变酶标仪测定中性红染色A54计算抑毒指数评价抗病毒效果。结果白颖苔草丙酮乙酸乙酯粗提物可抑制RFl的胞病变效应,抑毒指数分别为142.41,x病毒的抑毒指数为。结论白颖苔草对RFl具显著的抑制作用而对Cox无抑制作用[2。再如褚秀玲等采用中性红染色法检测人参皂苷及其衍生物抗马立克病毒作用的研究研究结果表明先加中药后感染病毒时,人参皂苷和衍生物表现出较强的抑制病毒活性作用；先接病毒后加中药时,人参皂苷和衍生物表现出较强的抑制病毒活性作用；病毒和药物混合感作后加入细胞时,衍生物7,表现出较强的抑制病毒活性作用综合种加药试验结中药抑制病毒活性作用由强到弱的顺序依次为衍生物、人参皂苷、衍生、衍生物、衍生物和衍生物80][1]、蚀斑减少法实验证明将病毒接种于单层培养细胞数天后固定细胞并染色因病毒感染而导致变性的细胞不被染色形成蚀斑空斑蚀斑降低法以此为基础利用蚀斑的形成以接种病毒后在未添加试验药物的培养基上形成的蚀斑数为100%,通过计算添加试验药物的培养基上形成的蚀斑减少率来研究试验药物的抗病毒活性。通常用于对照的蚀斑数为50-超过该范围药物的感受性即降低,且会影响实验结果。另外蚀斑缩小也是抗病毒活性的指标。因此蚀斑降低法是一种定量测定法理论上一个蚀斑代表一个有感染性毒粒药物处理后蚀斑数减少表示病毒复制受到抑制子代毒粒产生减少蚀斑降低法定量准确结果可靠。用一系列药物浓度可得到剂量反应曲线适用于不同药物抑制强度的比较由于操作较复杂。需较多细胞及药物不适合初筛可作为二筛或有效药物的效价评估。、病毒抗原的测定有些病毒不产生细胞病变或蚀斑或者产生细胞病变过程较慢如乙型肝炎病毒、E病毒、巨细胞病毒等。病毒复制过程可产生各种病毒基因编码的蛋白质如表面糖蛋白衣壳蛋白酶蛋白及调控蛋白等这些蛋白为病毒的结构蛋白或功能蛋白出现于病毒繁殖周期的不同阶段均可作为病毒复制程度之指征利用抗原抗体特异结合的免疫学原理用特异抗体检测某一特异抗原尤其单克隆抗体的应用更明显地提高了免疫检测法的特异性。另外可利用定量P荧光定量P方法测定病毒核酸。参考文献[1]贝贝叶荷平,HUAN等青钱柳抗菌作用的实验研究[J江西中医学院学报,2006,18(4):48-49.[2]利权伍义行火绒草的抗菌活性研究[J].医医药杂志,2006,105(1)5-6.[3]菁菁蓝玉簪龙胆提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌作用的实验研究[J].药理学通报,2011,27(7):1024-1026.[4胡景玉杜红丽乔艳梅等.2大肠埃希菌临床分离株药敏分析[J].代预防医学,2012,39(21):5664-5666.[5] KianbakhtS,JahanianiF.EvaluationofTribulusrestrisowinIran[IraniJaonurnalPharmacologyandTherapeutics,2003,2(1):22[6]黎虹关瑞章李忠琴等.1种单味中药对养殖鳗鲡主要致病菌的抑制作用[J].大学学报自然科学版),2010,15(6):1-5.[7]芳虞涛鲍连生等.2009汉地区住院患儿分离肺炎链球菌的耐药分析[J].医院感染学杂志,2011,21(5):1040-1042.[8]加庆陈鹏沈志强等利胆止痛胶囊对小鼠抗抑菌炎镇痛和利胆作用研究[J].医学院学报2011,32(1):10-15.[9