苯酚-硫酸比色法测定白多糖的研究

苯酚-硫酸比色法测定白多糖的研究

白蜡树是兰科植物的干燥茎，也被称为小白牙、莲草和雪末。白芨多糖具有收敛止血、消肿生肌等功能实验以葡萄糖为标准品,采用苯酚-硫酸比色法(硫酸将白芨多糖催化水解成单糖,单糖迅速脱水生成糠醛及其衍生物再与苯酚或蒽酮作用生成有色物质1材料和方法1.1材料表面1.1.1兰科白(白)白芨:购买于瑞丽市台丽街综合批发市场(经鉴定为兰科白芨属白芨)。将白芨块茎洗净,沥干,切片,放入烘箱60℃烘干、粉碎后,过40目筛,收集,放入干燥器中密封保存,备用。1.1.2试剂葡萄糖标准品,优级纯,国药集团化学试剂有限公司;苯酚,分析纯,天津市化学试剂三厂;浓硫酸,分析纯,重庆东川化工。1.1.3紫外-可见分光光度仪、电子天平、药材粉碎机T6型紫外-可见分光光度仪(北京普析通用仪器有限公司);UV-8000ST紫外-可见分光光度仪(上海元析仪器有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);中药材粉碎机(台湾弘荃机械企业有限公司);电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)。1.2方法1.2.1滤渣的提取称取白芨粗粉2.0kg,用75%乙醇提取2次,每次2h,过滤,滤渣干燥。称取干燥后的滤渣1.0kg,加入15倍量的水提取2h,离心过滤后,滤渣再用10倍量的水提取2h,合并滤液。将滤液浓缩至相对密度为1.15,加入95%乙醇,边加边搅拌,直至大量沉淀产生,静置过夜,滤出沉淀,干燥、粉碎即得白芨粗多糖。1.2.2白粗多糖待测样品溶液的制备葡萄糖标准溶液配制精密称取已恒重的葡萄糖标准品0.1001g,溶解后,转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,充分摇匀,静置30min。吸取2.0mL于50mL容量瓶中,定容,摇匀后,即得40.04ug/mL的葡萄糖标准溶液。待测样品溶液配制精密称取已恒重的白芨粗多糖0.1000g,溶解后,转移至100mL容量瓶中,定容至刻度,充分摇匀静置30min。吸取2.0mL于50mL容量瓶中,定容,摇匀后,即得白芨粗多糖待测样品溶液。6%苯酚溶液的配制精密称取苯酚6.00g,溶解后,转移至100mL棕色容量瓶中,定容,充分摇匀,静置,避光保存。1.2.3浓硫酸溶液的加入分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、1.0mL于2支具塞比色管中,使总体积均为1.0mL,加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后,沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀,静置,冷却。以葡萄糖标准溶液0.0mL为空白对照,选择400～600nm波长范围,按10.0nm的精度进行多波长扫描,以吸收波长λ为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制吸光度-吸收波长关系曲线,确定最大吸收波长。1.2.4浓硫酸加入量分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0mL,置于9支具塞比色管中,依次加入6%苯酚溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,加水使各管体积均为3.2mL,摇匀,各管分别沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀,静置30min。冷水冷却,于490nm处测定吸光度。以苯酚用量为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制吸光度-苯酚用量关系曲线,确定苯酚溶液用量。1.2.5浓硫酸加入量分别吸取葡萄糖标准溶液各1.0mL,置于9支具塞比色管中,依次加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0mL,加水使各管体积均为9.2mL,摇匀静置60min。冷水冷却后,于490nm处测定吸光度。以浓硫酸用量为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制吸光度-浓硫酸用量曲线,确定浓硫酸用量。1.2.6浓硫酸温度的确定分别吸取葡萄糖标准溶液1.00mL,置于9支具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀,分别静置10、20、30、40、50、60、70、80、90min。冷水冷却后,于490nm处测定吸光度。以反应时间t为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制吸光度-反应时间曲线,确定反应的适宜时间及稳定性。1.2.7葡萄糖吸光度的测定分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于具塞比色管中,加水使体积均为1.0mL,加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀静置60min。冷水冷却后,以葡萄糖标准溶液0.0mL为空白对照,于490nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。1.2.8浓硫酸溶液的加入分别精确吸取1.0mL葡萄糖标准溶液于5支具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀静置60min。冷水冷却后,以葡萄糖标准溶液0.0mL份为空白对照,于490nm处测定吸光度,计算相对标准偏差(RSD%)。1.2.9苯酚用量的确定精密称取白芨样品5份,每份质量0.1000g,依次向白芨样品中加入0.0700g葡萄糖标准品,溶解定容至100mL容量瓶中,摇匀,静置。吸取2.0mL白芨样品溶液,定容于50mL容量瓶,摇匀,静置。吸取0.4mL于具塞比色管中,加水使体积均为1.0mL,分别加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀,静置60min,冷水冷却后,以葡萄糖标准溶液0.0mL为空白对照,于490nm处测定吸光度。计算多糖含量及加标回收率。加标回收率=(加标后多糖测定量-样品中多糖量)/葡萄糖标准品加入量×100%1.2.1浓硫酸溶液的配制精密称取已恒重的白芨粗多糖6份,每份质量0.1000g,配制成白芨粗多糖待测样品溶液,吸取6份待测样品溶液各1.0mL于具塞比色管中,加入6%苯酚溶液1.2mL,摇匀后沿管壁缓慢加入浓硫酸6.5mL,摇匀,静置60min。冷水冷却后,于490nm处测定吸光度,依据标准曲线计算白芨粗多糖样品中多糖含量。2结果与分析2.1吸收最大波长的选择由表1、图1可知,最大吸收波长为490nm。2.2苯酚用量的影响由表2、图2可知。苯酚用量在0.2～1.2mL,吸光度与苯酚用量呈正相关,且具有一定线性关系;当苯酚用量达到1.2mL时,吸光度出现最大值;之后,随着苯酚用量的增加,吸光度反而逐渐下降。因此,最佳苯酚用量为1.2mL。2.3浓硫酸用量的影响由表3、图3可知,使用1.2mL6%的苯酚溶液,浓硫酸用量在3.0～6.5mL时,吸光度与浓硫酸用量呈正相关;当浓硫酸用量达到6.5mL时,吸光度出现最大值;之后,随着浓硫酸用量的增加,吸光度呈现逐渐下降趋势。因此,最佳硫酸用量为6.5mL。2.4反应时间和时间对吸光度的影响由表4、图4可知,在1.2mL6%苯酚溶液,6.5mL浓硫酸条件下,反应时间为10～60min时,吸光度值呈现逐渐增加趋势;当反应时间为60min时,吸光度出现最大值;之后,随反应时间增加,吸光度呈现逐渐下降趋势。由此,可以确定加入浓硫酸后的最佳反应时间为60min,总体来说,反应时间内,吸光度变化较小,呈现比较稳定的变化趋势。2.5吸光度值-葡萄糖浓度的线性回归通过对吸光度-葡萄糖浓度数据进行线性回归,得到吸光度值-葡萄糖浓度的线性回归方程:y=0.009x+0.0023,线性相关系数R2.6u3000标准偏差由表6可知,精密度实验的平均吸光度为0.2984,标准偏差STDEV为0.00343,相对标准偏差RSD为1.148%。表明该方法精密度较高,满足实验要求。2.7加标回收率实验由表7可知,5份平行样测定的加标回收率为98.24%～100.29%,平均加样回收率为99.11%,标准偏差STDEV值为0.7565,相对标准偏差RSD为0.7633%,实验结果满足加标回收率要求,表明该方法的准确度较好。2.8实验结果由表8可知,白芨多糖平行样品测定的多糖含量为65.5%～66.5%,平均多糖含量为66.08%,标准偏差STDEV值为0.3764,相对标准偏差RSD为0.5696%,实验结果满足相关要求,方法重现性好。3白多糖水解液的制备由于苯酚是一种弱酸性的酚类物质,在空气中久置很容易吸水潮解或部分氧化为苯醌,导致纯度、有效浓度下降,进而影响显色反应,使测定结果有所偏离。因此,苯酚需要密封存放在干燥环境中,且现配现用;浓硫酸在反应中主要是将白芨多糖水解为单糖,并脱水生成糖醛衍生物。实验过程中,浓硫酸与样品反应若摇动不充分,使多糖水解为单糖不彻底也会影响多糖含量的测定结果。因此,为保证结果的准确性,加入浓硫酸后应充分摇匀,静置水解,以减小实验测