葫芦茶的分离、评价和开发

葫芦茶的分离、评价和开发

肝纤维是肝纤维异常积聚的病理过程。它不是一种独立的疾病，而是许多慢性肝病的共同病理特征。葫芦茶为豆科植物葫芦茶[Tadehagitriquetrum(L.)Ohashi]的枝叶，是广西常用壮药，壮名“Gohuzluzcaz.”，主要分布于广西、广东、海南等地。该药味苦、涩，性凉，具有清热解毒、利湿退黄、消积杀虫的功效，临床上常用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、肺痈、黄疸肝炎、肠炎、风湿关节痛、小儿疳积等症1材料表面1.1高速冷冻多元离心复合材料722S型可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；TDL-5型台式低速大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；WH-1型微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器有限公司）；5810R型高速冷冻多用途离心机（德国Eppendorf公司）；GelDoc2000型凝胶成像分析系统、PAC-300型低压电泳仪、9700型聚合酶链反应（PCR）扩增仪、HD-4N型核酸蛋白测定仪、Model450型自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；5200型全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）；DY89-Ⅱ型匀浆器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。1.2试剂与试剂盒葫芦茶苷对照品（纯度：>98.0%）由本课题组从葫芦茶[T.triquetrum(L.)Ohashi]枝叶中分离所得，临用前用2%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液稀释，制成相应质量浓度的混悬液；秋水仙碱片（广东彼迪药业有限公司，批号：20181001，规格：0.5mg）；丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、羟脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号分别为20170801、20170601、20170801、20171221、20170601、20171022）；透明质酸（HA）、白细胞介素6(IL-6）试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号分别为N20012900、AK0017FEB22012);FirstStrandcDNASynthesisKit（美国MBI公司，批号：00064478);2×PCRTaqMix（日本Takara公司，批号：9108）；兔抗小鼠基质金属蛋白酶2(MMP-2）抗体、兔抗小鼠转化生长因子β1.3实验动物：中国广西gSPF级健康昆明种小鼠，雌雄各半，体质量（20±2)g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK（桂）2014-0003。实验室温度为（20±2）℃，所有小鼠均自由进食、饮水。2方法2.1对等效剂量的设定将昆明种小鼠60只随机分为正常组、模型组、秋水仙碱组（阳性对照，0.2mg/kg，剂量设置参照人等效剂量换算而得）以及葫芦茶苷低、中、高剂量组（3、6、12mg/kg，剂量设置参照本课题组前期研究结果），每组10只。所有小鼠禁食过夜后，正常组小鼠腹腔注射等体积橄榄油，其余各组小鼠均腹腔注射10%CCl2.2elisa检测相关血清中相关免疫指标末次给药10h后，所有小鼠均摘取眼球取血，分离血清，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）以自动酶标仪检测其血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量。严格按照相应试剂盒说明书操作。2.3肝组织蛋白的测定小鼠取血后立即脱颈处死，剖取肝脏，于肝脏右叶相同部位取肝组织约0.1g，置于含生理盐水的匀浆器中，于冰浴中制备成10%肝匀浆。采用考马斯亮蓝法对肝组织蛋白进行定量后，采用分光光度法以可见光分光光度计检测其肝组织中Hyp、SOD、MDA、GSH-Px的含量。严格按照相应试剂盒说明书操作。2.4rt-pcr扩增取小鼠肝组织适量，采用Trizol法提取肝组织总RNA。取上述总RNA2µg，按FirstStrandcDNASynthesisKit说明书方法，在M-MLV逆转录酶作用下逆转录合成cDNA。以上述cDNA为模板，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）以PCR扩增仪进行扩增。反应体系（20µL):cDNA模板2µL,10µmol/L的上、下游引物（序列见表1）各lµL,2×PCRTaqMix10µL，用无酶水补至20µL。反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s，适宜温度（Col-Ⅰ：55℃；TIMP-1和TIMP-2:52℃）退火30s,72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸10min。反应结束后，取扩增产物2.0µL，进行琼脂糖凝胶电泳（电压：110V，时间：15min），并置于凝胶成像分析系统上成像。采用Image-proPlusV7.0图像分析，以目的基因和内参β-actin条带的光密度（OD）值比值来表示目的基因mRNA的表达水平。上述试验重复3次。2.5sds-采用电泳分离法检测ca-ldf蛋白表达采用Westernblotting法检测。取小鼠肝组织适量，加入RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制剂）1mL，于4℃下裂解后，并于4℃下以12000r/min离心10min。取上清液，采用BCA法测定蛋白含量，随后加入SDS蛋白上样缓冲液适量，于95℃水浴中变性5min。取变性后的蛋白进行SDS电泳分离（电压：80V，时间：30min），电泳完成后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入相应一抗（稀释度均为1∶1000),4℃孵育过夜；用TBST溶液清洗5min×3次，加入二抗（MMP-2和TGF-β2.6统计方法采用SPSS19.0软件对数据进行统计处理。计量资料以3结果3.1il-6含量与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT、AST、HA、IL-6的含量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠血清中上述指标的含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见表2。3.2hyp、mda含量与正常组比较，模型组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px含量均显著降低，而Hyp、MDA含量均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织中SOD、GSH-Px含量均显著升高，而Hyp、MDA含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见表3。3.3timp-2mrnna的表达水平与正常组比较，模型组小鼠肝组织中Col-Ⅰ、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组小鼠肝组织中上述指标的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见表4。3.4肝组织中的bup-2和tgf-a与正常组比较，模型组小鼠肝组织中MMP-2、TGF-β4cclhip蛋白的氨基酸成分肝纤维化是肝硬化以及肝功能衰竭的共同病理基础和必经阶段，是影响慢性肝病进展的重要环节，因此肝纤维化的预防、治疗乃至逆转是阻止肝硬化发生的关键环节CCl血清中ALT、AST含量是评价肝细胞受损的基本指标，在CClHyp是胶原蛋白结构中特有的氨基酸成分，在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中含量极低；当肝纤维化发生时，胶原蛋白的含量明显增加，且Hyp的含量与肝纤维化