抗体药物制备工艺课件

制药工艺学PharmaceuticalTechnology制药工艺学PharmaceuticalTechnolog抗体药物制备工艺第一节抗体概述第二节鼠源单克隆抗体制备第三节基因工程抗体抗体药物制备工艺第一节抗体概述第一节抗体概述一、抗原与抗体二、抗体结构三、抗体制备技术的发展概述抗体制备第一节抗体概述一、抗原与抗体概述抗体制备一、抗原与抗体概述抗体制备一、抗原与抗体概述抗体制备1、抗体的概念抗体是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能免疫的球蛋白。它与免疫球蛋白的区别：抗体都是免疫球蛋白，免疫球蛋白不一定都具有抗体活性功能。抗体是一个生物学和功能性概念，而免疫球蛋白是一个结构性概念。概述抗体制备1、抗体的概念抗体是能与相应抗原特异性结合的具有特定功能免2、抗原的概念抗原是能刺激机体产生免疫应答并能与应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异结合的物质蛋白质性抗原：在缺乏T淋巴细胞时，不能引起抗体产生反应，也称为T依赖性抗原。非蛋白抗原：包括多糖、脂类及核酸等，在无T细胞时，也能产生抗体，称为非T依赖性抗原。概述抗体制备2、抗原的概念抗原是能刺激机体产生免疫应答并能与应答产物3、抗原的概念抗原中与抗体结合的部位为抗原决定簇或表位，蛋白性抗原：多个不相同决定簇，非多价抗原。线性决定簇：相邻的氨基酸残基构成，一般包括6个氨基酸残基构象决定簇：空间相互靠近的氨基酸残基组成。多糖、核酸抗原：多个相同决定簇，多价抗原概述抗体制备3、抗原的概念抗原中与抗体结合的部位为抗原决定簇或表位，概述二、抗体结构概述抗体制备二、抗体结构概述抗体制备1、抗体的生成在B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中，生成抗体非成熟B淋巴细胞阶段：合成κ和λ轻链，与μ链组装形成IgM，表达于细胞表面。抗原与成熟B淋巴相遇，抗原与IgM和IgD结合，B细胞增殖活化为浆细胞，促使抗体V区发生突变，即亲和力成熟。抗体由膜型转变为分泌型时，C区发生类别转换，便于抗体行使功能。概述抗体制备1、抗体的生成在B淋巴细胞分化为浆细胞的过程中，生成抗体概1、抗体生成在一种抗原刺激下，生成的抗体具有多样性，这是因为：每种抗原能具有不同的抗原决定簇，每一种抗原决定簇可由达1000-8000种不同的抗体所识别。不同种系动物产生抗体混合物也不同不同个体对于同一抗原决定簇的反应也不同即使同一个个体在不同时间的反应也不尽相同概述抗体制备1、抗体生成在一种抗原刺激下，生成的抗体具有多样性，这是因2、抗体与抗原的相互作用抗体的V区互补决定区形成的三维构象与抗原高级结构表面的决定簇之间的反应，非共价键结合，包括静电引力、氢键、范德华力、疏水作用力等。抗体的功能是结合抗原，通过三种方式中和、除去有害物质：直接使抗原失活；使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏；抗原表面弱化，易受补体破坏。概述抗体制备2、抗体与抗原的相互作用抗体的V区互补决定区形成的三维构象3、抗体的结构单体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成的四聚体。轻重链间和重链间以二硫键连接，形成“Y”字型结构。概述抗体制备3、抗体的结构单体由2条相同的重链和2条相同的轻链组成的四聚三、抗体制备技术发展19世纪末:用天然抗原通过免疫动物，从血清中获得多克隆抗体，为第一代抗体。缺点是非特异性，交叉反应。20世纪70年代:B细胞与骨髓瘤细胞融合,杂交瘤生产，一种抗原决定簇的均一单克隆抗体，第二代抗体。缺点是存在免疫原性20世纪80年代后：人源化抗体、小分子抗体并用原核细胞表达抗体，第三代基因工程抗体。概述抗体制备三、抗体制备技术发展19世纪末:用天然抗原通过免疫动物，从血第二节鼠源单克隆抗体的制备一、杂交瘤细胞系的建立二、杂交瘤细胞的培养三、抗体的分离纯化鼠源单克隆抗体抗体制备第二节鼠源单克隆抗体的制备一、杂交瘤细胞系的建立鼠源单克隆一、杂交瘤细胞系的建立淋巴细胞的制备:按免疫程序，用特异性抗原免疫纯系健康8周龄的BALB/c小白鼠，分离B淋巴细胞。骨髓瘤细胞：核酸代谢旁路酶缺陷型（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶HGPRT-

或胸腺嘧啶核苷激酶KT-）原生质体融合：将对数期的骨髓瘤细胞与新鲜B淋巴细胞混合，用PEG为诱导剂，进行细胞融合在HAT培养基中选择培养鼠源单克隆抗体抗体制备一、杂交瘤细胞系的建立淋巴细胞的制备:按免疫程序，用特异性抗一、杂交瘤细胞系的建立在HAT培养基中选择培养融合细胞：亲本B细胞不能离体培养，5-7d后自行死亡，亲本骨髓瘤细胞是缺陷型，在选择培养基上不能生长。只有融合细胞才能正常生长，被筛选出来。培养过程中，检查是否污染，隔日换培养液。单克隆细胞筛选：对形成的集落，有限次数稀释，分离出单个细胞，进行特异性抗体筛选，使其克隆化。淘汰遗传不稳定的杂交瘤细胞，从细胞群体中筛选出遗传性稳定、分泌抗体均一的同源性细胞系，建库，保存。鼠源单克隆抗体抗体制备一、杂交瘤细胞系的建立在HAT培养基中选择培养融合细胞：亲本二、杂交瘤细胞培养1、体内培养工艺：在小鼠或大鼠腹腔内，杂交瘤生长分泌单克隆抗体给小鼠注射异十八烷或液体石蜡使致敏，8-10d后，向腹腔接种杂交瘤细胞。2-4天后腹部涨大，1-2周时开始抽取腹水，隔日采集，直至动物死亡。也可在最大腹水时处死动物，一次性抽取腹水。血清来生产单克隆抗体：杂交瘤细胞皮下植入动物体内，一段时间后，出现肿瘤，采血清制备单克隆抗体。鼠源单克隆抗体抗体制备二、杂交瘤细胞培养1、体内培养工艺：鼠源单克隆抗体抗体制备多用无血清培养基杂交瘤细胞的悬浮培养产生的抗体滴度较低高密度的微囊化培养适合抗体生产，抗体截留在微囊内，纯度较高，约50％，有利于分离纯化。二、杂交瘤细胞培养鼠源单克隆抗体抗体制备2、体外培养工艺多用无血清培养基二、杂交瘤细胞培养鼠源单克隆抗体抗体制备2、三、单克隆抗体纯化离心：除去细胞碎片及脂类等，澄清溶液。加入硅胶及其他吸附剂，有利于分离。沉淀：用硫酸铵沉淀，获得粗品。用辛酸—硫酸铵沉淀或硫酸铵-DEAE离子交换色谱获得单克隆抗体。纯化：离子交换、ProteinA-sephrose4B和ProteinG-sephrose4B亲和层析，羟基磷灰石分离、疏水色谱。离子交换色谱后抗体超度达99％，用凝胶过滤等纯化，可用于制备相应的剂型。鼠源单克隆抗体抗体制备三、单克隆抗体纯化离心：除去细胞碎片及脂类等，澄清溶液。加入鼠源单克隆抗体制备的基本过程鼠源单克隆抗体抗体制备鼠源单克隆抗体制备的基本过程鼠源单克隆抗体抗体制备人源化抗体小分子抗体第三节基因工程抗体基因工程抗体抗体制备人源化抗体第三节基因工程抗体基因工程抗体抗体制备一、人源化抗体基因工程抗体抗体制备一、人源化抗体基因工程抗体抗体制备1、人鼠嵌合抗体针对鼠源性而进行基因改造，降低或消除免疫原性，保持或提高亲和力和特异性是改造抗体的二个基本原则。人鼠嵌合抗体：由鼠抗体的可变区和人抗体的稳定区组成，用人C区基因取代鼠C区基因，在空间结构上相对独立，大大降低免疫原性。基因工程抗体抗体制备1、人鼠嵌合抗体针对鼠源性而进行基因改造，降低或消除免疫原性1、人鼠嵌合抗体制备可变区基因的克隆。用杂交瘤细胞的mRNA为模板，RT-PCR，克隆鼠可变区基因。表达载体的构建。将轻链和重链分别构建成相应的表达盒，连接到同一个高效载体中。嵌合抗体的表达与制备。共转染哺乳动物细胞系如CHO和骨髓瘤细胞中，按照动物细胞培养工艺生产。缺点：保留30％左右的鼠源序列，并没有完全消除免疫原性的发生并具有全抗体的缺点。基因工程抗体抗体制备1、人鼠嵌合抗体制备可变区基因的克隆。用杂交瘤细胞的mRNA2、改型抗体制备改型抗体是把鼠单克隆抗体的互补决定区（CDR）移植到人单克隆抗体的骨架区，使人单克隆抗体获得同鼠单抗一样的抗原特异性，也称为CDR移植抗体。鼠杂交瘤细胞系克隆鼠可变区基因并测序设计改型人可变区基因构建人可变区和恒定区基因载体改型抗体基因工程抗体抗体制备2、改型抗体制备改型抗体是把鼠单克隆抗体的互补决定区（CDR3、人源化抗体人-人杂交瘤融合率低、不稳定，用传统杂交瘤技术制备高亲和力稳定的人抗体克隆十分困难。可以用噬菌体抗体库技术、基因敲出技术、置换技术、制备完整全人源抗体片段及全抗体。基因工程抗体抗体制备3、人源化抗体人-人杂交瘤融合率低、不稳定，用传统杂交瘤技术4、融合抗体融合抗体是抗体与其他蛋白融合表达的产物，具有抗体和其他蛋白的双重功能，形成新的生物活性。免疫毒素：抗体与毒性蛋白融合，定向杀伤肿瘤。Fc、Fab、Fv等,绿脓杆菌外毒素、白喉毒素等。免疫毒素只能用大肠杆菌制备免疫抗体：抗体片段与细胞因子或受体分子融合，IL-2/IgG1、TNFR/IgG1、IFNrR/IgG1等。基因工程抗体抗体制备4、融合抗体融合抗体是抗体与其他蛋白融合表达的产物，具有抗体二、小分子抗体小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗体片段。优点：可以在大肠杆菌等细胞中原核表达，生产成本低；容易穿透血管壁或组织屏障，进入病灶部位，有利于治疗肿瘤等；不含有Fc片段，不与Fc受体结合；有利于进一步进行基因工程改造。基因工程抗体抗体制备二、小分子抗体小分子抗体是分子量较小的具有抗原结合功能的抗体Fab制备技术Fab结构：由VH和CH1和完整轻链（VL和CL）组成，通过二硫键连接形成异二聚体，其大小只有完整全抗体分子1/3，仅有一个抗原结合位点。Fab的制备：第一条路线：木瓜蛋白酶水解全抗体

分离纯化制备Fab。第二条路线：基因工程大肠杆菌表达第三条路线：基因工程动物细胞表达重组Fab抗体。人源性恒定区，H链的V区和CH1区的cDNA与L链完整的cDNA重组。基因工程抗体抗体制备Fab制备技术Fab结构：由VH和CH1和完整轻链（VL和CFv由轻链可变区和重链可变区组成，以非共价键结合。可用前导肽引导在基因工程细菌中表达Fv的两个片段，分泌进入周质，组装成Fv。Fv是非共价键结合，不稳定，应用最多是单链抗体ScFv。VL区cDNA5端与VH区cDNA3端用接头连接，构成单链可ScFv，大小只有全抗体的1/6。接头长度不短于3.5nm，大多含有14～15个氨基酸残基。最广泛使用的接头是(GGGGS)3。ScFv可在大肠杆菌、酵母、