血小板的检测原理及误差分析课件

血小板的检测原理及误差分析学术应用部张文忠1血小板的检测原理及误差分析学术应用部张文忠1血小板基础什么是血小板？血小板（platelet,PLT）是由骨髓造血组织中的巨核细胞产生，具有维持血管内皮完整性以及黏附、聚集、释放、促凝和血块收缩等功能。正常血小板形态呈两面微凸的圆盘状，直径约1.5-3um，新生血小板体积大，成熟血小板体积小。正常血小板2血小板基础什么是血小板？正常血小板2大血小板血小板聚集异常形态血小板血小板卫星现象3大血小板血小板聚集异常形态血小板血小板卫星现象3血小板检测方法及原理1、流式细胞仪法：用免疫法荧光素标记特异的血小板单克隆抗体，常用CD41或CD61，用流式细胞仪计数血小板。目前为ICSH推荐的参考方法2、血液分析仪法：主要检测原理包括点阻抗法和（或）光（或荧光）散射法，为常用方法3、相差显微镜直接计数法：相差显微镜下，血小板立体感增强，有助于识别血小板4、普通显微镜直接计数法：按不同的稀释液，可分为破坏和不破坏红细胞的PLT计数，稀释液可用草酸铵、复方尿素、高铁氰化钾。4血小板检测方法及原理1、流式细胞仪法：用免疫法荧光素标记特异Sysmex-XN系列PLT检测方法1、电阻抗法（PLT-I）2、光学法（PLT-O）3、荧光法（PLT-F）5Sysmex-XN系列PLT检测方法1、电阻抗法（PLT-I电阻抗法（PLT-I）电阻抗法（PLT-I）：悬浮在电解质溶液中的血细胞相对于电解质溶液为非导电颗粒，其电阻比电解质溶液大，利用两者导电性的差异，当体积大小不同的血细胞（或类似颗粒）通过计数小孔时，可引起小孔内、外电流或电压的变化，形成与血细胞数量相当、体积大小相当的脉冲电压，从而间接区分细胞，电流或电压变化的频次即为细胞（或颗粒）的数量，故此法可受小红细胞、红细胞碎片、小微粒、大血小板、血小板聚集等的影响6电阻抗法（PLT-I）电阻抗法（PLT-I）：悬浮在电解质溶PLT-I浮动界标*鞘流阻抗法浮动界标7PLT-I浮动界标*鞘流阻抗法浮动界标7血小板直方图分布范围：LD(2～6)Fl;UD(12-30）fl之间反映参数：PLT、MPV、PDW高位干扰：小RBC、大血小板，血小板聚集低位干扰：电流、尘埃等PLPU100%20%10fl20fl30fl40fl12fl8血小板直方图分布范围：LD(2～6)Fl;UD(12-30）PDW/P-LCRPDW

假设峰值高度为100%，在20%频率水平上的分布宽度即为PDW。单位用fL表示，其中1fL=10-15L。P-LCRP-LCR为由12fL界标或更大界标得到的巨型血小板的比值。计算时，将固定界标与高界标之间的粒子数，同低界标与高界标之间的粒子数相比而得到一个比值。9PDW/P-LCRPDW9PLT-I方法学优缺点优点：目前常规筛检PLT的主要方法1.检测速度快2.重复性好3.准确性高4.同时提供多项指标缺点：容易受干扰因素影响，导致结果出现偏差1.假性增高：小红细胞、红细胞碎片、微小细胞碎片2.假性减低：微小血小板、大血小板、血小板聚集10PLT-I方法学优缺点优点：目前常规筛检PLT的主要方法10光学法（PLT-O）光学法（PLT-O）：在RET通道中，荧光染液（主要成分为聚次甲基、噁嗪）能够对细胞内的RNA和部分DNA染色，通过光信号的强弱区分细胞（RET通道特异性针对红细胞膜表面的RNA）。侧向荧光（SFL）前向散射光（FSC）白细胞强强网织红细胞中强红细胞弱强血小板弱弱11光学法（PLT-O）光学法（PLT-O）：在RET通道中，荧PLT-O优缺点优点：避免小红细胞、红细胞碎片、小微粒引起的PLT假性增高避免大血小板引起的PLT假性减低缺点：假性减低：微小血小板、血小板聚集12PLT-O优缺点优点：12荧光法（PLT-F）PLT-F：使用专用通道，染色液FluorocellPLT主要对含核酸丰富的细胞内构造进行染色主要是小胞体（核糖体RNA）和线粒体（MtDNA），PLT-F检测颗粒数是PLT-O或PLT-I的5倍，能够同时报告IPF（网织血小板或未成熟血小板），PLT-F通道对血小板聚集更加敏感。13荧光法（PLT-F）PLT-F：使用专用通道，染色液FluoSFLSFLFSCPLT-O(XE)PLT-F(XN)FSCPLT-FPLT-OIPFIPFLowersizePLTLowersizePLTPLT-F与PLT-O的差异PLT-F通道的染液对PLT的染色效果更敏感，微小血小板能够检出检测颗粒数是PLT-O或PLT-I的5倍14SFLSFLFSCPLT-O(XE)PLT-F(XN)F各PLT测定模式的重复性比较低值范围的血小板样本中，PLT-F测定的精度最高无PLT体积分布异常报警信息有PLT体积分布异常报警信息单位15各PLT测定模式的重复性比较低值范围的血小板样本中，PLT-在没有干扰的情况下Correlationwithimmnologicalmethod(anti-CD-61

Ab;Abbott).Subjects:SampleswithPLT-Imeasurementabnormality(n=120),fragments,g-PLTandsoon.X-axis:anti-CD61method,Y-axis:PLT-I,-Oor-F16在没有干扰的情况下CorrelationwithimmnIPF（RP）的临床意义血小板减少症的病因学诊断生成减少：再障、白血病及肿瘤，由于骨髓受抑制，血小板总数减少，RP比例大致正常，而RP绝对值明显低于正常破坏增加：ITP，骨髓生成血小板加快，外周血中新生血小板增多，使RP比例升高。但由于血小板寿命缩短，使RP绝对值减少。脾亢虽有血小板减少，但RP比例接近正常，RP绝对值亦低于正常水平消耗增加：TTP，DIC，虽有血小板减少，但RP比例接近正常，RP绝对值亦低于正常水平

分布异常：脾大、血液被稀释等先天性：新生儿血小板减少症、巨大血小板综合征等

17IPF（RP）的临床意义血小板减少症的病因学诊断17血小板聚集血小板聚集散点图血小板未聚集散点图18血小板聚集血小板聚集散点图血小板未聚集散点图18FSCW(FSC-Width)FSCFSCLaserFSCDirectionofSheathFlowNormalPlateletsFSC_WFSC_WPLTClumpsLaserFSC19FSCW(FSC-Width)FSCFSCLaserFSPLT-F优点优点：高特异性，与CD41/CD61流式细胞仪检测相当排除网织红细胞影响，排除红细胞碎片及小红细胞影响排除微小血小板假性减少5倍颗粒检测，即使低值血小板依然有较高的精度PLT-F可检测IPF，为诊断PLT减少的原因提供分析数据敏感监测血小板聚集20PLT-F优点优点：20误差分析血小板聚集小红细胞/红细胞碎片巨大血小板21误差分析血小板聚集211、血小板聚集引起的血小板减少症221、血小板聚集引起的血小板减少症22镜检23镜检23EDTA和肝素抗凝不良是引起假性血小板减少症最常见的原因。IgG自身抗体是EDTA-抗凝不良的主要原因，导致血小板聚集，血小板计数假性降低。常见病例：免疫疾病：自身免疫性疾病，淋巴增生性疾病患者较多感染症：败血病，病毒感染等一过性假性血小板减少药物：有报告说部分抗生素引起的病例，但致病机理不明自身抗体：有报告说健康人有发生解决方案：枸橼酸钠，肝素，无抗凝，vortex搅拌仪器搅拌，氟化钠+EDTA的血糖采血管；自身抗体引起的聚集也可采取血浆置换的方法24EDTA和肝素抗凝不良是引起假性血小板减少症最常见的原因。2、小红细胞+红细胞碎片252、小红细胞+红细胞碎片2526262727分析思路：PLT直方图出现大幅度抬高，MCV值为53.2，并报警有红细胞碎片，从PLT直方图目测其高值鉴别线在25-30fl之间，怀疑是高值鉴别线较高原因把部分小红细胞和红细胞碎片计入了血小板里，出现PLT-I假性增高。而在PLT-F通道可以排除小红细胞和红细胞碎片的干扰，并对血小板值进行修正。28分析思路：PLT直方图出现大幅度抬高，MCV值为53.2，并镜检解决方案：显微镜镜检发现有红细胞大小不均，有大量红细胞碎片存在。血小板散在分布，数量正常。此种情况下，PLT-I必然假性增高，使用PLT-F可以完全排除干扰29镜检解决方案：293、巨大血小板刘某，女70岁，因身体不适，在县城二级医院就诊，血常规检查，WBC:6.1*10E9/L，RBC:5.4*10E12/L，HGB:132g/L,PLT:10*10E9/L，转诊至某三甲医院血液科就诊，PLT-I：8*10E9/L，使用PLT-F通道后，PLT-F：24*10E9/L,IPF:75.8%，推片镜检，可见血小板明显减少，血小板体积明显增大。303、巨大血小板刘某，女70岁，因身体不适，在县城二级医院就诊31313232分析思路：在RBC/PLT通道中，只是通过体积鉴别，无法将巨大血小板和红细胞分开。在PLT-F通道中，采用特殊的染料使血小板进行染色计数。镜检：镜下发现巨大血小板，与PLT-F结果相符。PLT-F通道提供的IPF符合镜检