蜜蜂体内p450的活性及对农药毒性的反应

蜜蜂体内p450的活性及对农药毒性的反应

1真菌毒素检测喂食花粉、花蜜和蜂胶时，蜜蜂不可避免地会吸收一些植物产生的生物化学材料，并发现真菌毒素。在采集的过程中也会接触一些农药,尤其是一些杀螨药剂。蜜蜂通过体内的解毒酶对这些外源性物质进行初级分解,然而,截至目前需要大量研究来了解蜜蜂体内解毒酶的作用机理。2利用其他昆虫中的p450采用多种方法确定食物中的毒素对蜜蜂敏感性的影响,特别是蜜蜂对一些人工合成和天然外源性物质的敏感性,包括对杀螨剂氟胺氰菊酯、吡虫啉和黄曲霉毒素等的敏感性。通过研究了昆虫体内p450的潜在诱导物和第一阶段解毒的主要生化体系,明确如何调节解毒。在一些昆虫中,苯巴比妥可以诱导p450的表达,氟胺氰菊酯主要由p450酶降解,饲喂苯巴比妥后,氟胺氰菊酯对蜜蜂的毒性没有受到影响。与蜜蜂对氟胺氰菊酯的耐受性类似,给蜜蜂饲喂花椒毒素、水杨酸和吲哚乙酸后,也没有诱导蜜蜂的p450,虽然饲喂花椒毒素、水杨酸和吲哚乙酸可以诱导其他昆虫体内的p450表达。只有蜂蜜和花粉中含有的槲皮素可以诱导p450,降低氟胺氰菊酯的毒性。利用微阵列芯片技术,未发现饲喂过苯巴比妥的蜜蜂中肠中解毒酶基因表达发生变化,northern杂交分析表明在饲喂过蜂蜜、蜂花粉和蜂胶提取物的蜜蜂中肠内检测到3种p450CYP6AS基因的过量表达。生物测定中,蜜蜂食物并没有改变氟胺氰菊酯和吡虫啉的毒性,但与饲喂蜂蜜的蜜蜂相比,黄曲霉毒素对饲喂蔗糖或者高果糖浆的蜜蜂毒性更大。3蜜蜂对p450酶的诱导效应这些结果表明,蜜蜂体内p450s主要由蜂巢周围的自然物质调节,从毒理学上分析,蔗糖的饲喂效果无法与蜂蜜的效果相比拟。意大利蜜蜂是美国第一个人工控制的授粉者,它为超过90%的植物授粉,每年创造的经济价值超过140亿美元。由于一些环境中有毒物质的存在影响了蜜蜂的生命活动,进而影响整个农业领域。蜜蜂在采集的过程中,很容易接触到大量的农药。几十年来,大量的农药用来防治农业害虫和疾病防治,同时也造成蜜蜂的死亡和病变。尽管已经开始限制或者减少在农田和森林中使用农药,但是农药的继续使用仍造成非靶标生物蜜蜂的死亡。亚致死剂量的农药被认为是可以降低蜜蜂的生存能力,而且最近20a,一种具有毁灭性的寄生虫大蜂螨的存在,导致蜂巢内大量使用杀螨剂,进而给蜜蜂形成了更大的环境毒力压力,使得蜜蜂在整个生长周期内都接触农药,而大家仍未可知蜜蜂是怎么处理和承受这些有毒物质。与其他的昆虫一样,蜜蜂在一定程度上依赖其体内一系列的解毒酶来分解这些自然中有毒物质和农药。这一系列解毒酶中最重要的就是p450酶,p450酶在降解这些蜜蜂取食的花粉和花蜜中的植物化学物质发挥着作用。另外,蜂巢中贮存的大量花粉和食物为真菌和曲霉菌提供了适宜的环境,他们所产生的真菌毒素也可以被蜜蜂体内的p450s所降解。人工合成的杀虫剂也可以被蜜蜂体内的p450s所代谢。氟胺氰菊酯是一种拟除虫菊酯类农药,在蜂业生产中被用于防治大蜂螨,也可以被p450s所代谢。拟除虫菊酯类的高效氯氟氰菊酯和有机磷酸酯类的毒死蜱也可以被p450s所代谢。事实上,蜜蜂对于这些杀螨剂具有耐药性主要得益于蜜蜂体内p450s的快速降解作用,这也是蜂农在蜂群中安全使用这些杀螨剂来防治大蜂螨的原因。尽管农药的毒性随着种类的不同而不同,但是大多数的有机磷酸酯类和拟除虫菊酯类农药对蜜蜂是高毒性的。蜜蜂对农药的敏感性研究已经转移到对蜜蜂基因组测序的讨论。在许多害虫中,p450s是主要参与抗药性和耐药性的酶,但是,在西方蜜蜂基因组中只46个编码p450s基因,远低于其他昆虫的基因组。而且蜜蜂体内的羧酸酯酶和谷胱甘肽硫转移酶家族以及其他需氧生物体内的其他解毒酶都相对较少。研究表明,这些解毒酶种类的减少增加了蜜蜂对特定农药的敏感性。随着对蜜蜂生物学的了解,蜜蜂基因组测序提供了大量的研究蜜蜂对外源性物质的解毒机理的新方法。迄今为止,还没有发现揭示蜜蜂是如何处理食物中的一些植物化学物质、化学物质,或者其他的外源性物质的方法。蜜蜂体内缺少一些与解毒相关的基因,但会有一些行为机制减少毒素的吸收,这种现象表明蜜蜂体内的相关基因调控不同于其他的非社会性昆虫和食草动物。诱导作用是暴露在毒素下,导致解毒酶含量的增加的现象,这种现象经常诱导解毒基因的转录,这样就可以利用最小的资源提高新陈代谢能力,保护机体免受氧化损伤,这往往和p450活性增加相关。因为p450酶常常可以被一些底物所诱导,诱导效应被当作是识别生物体耐药性和对外源性物质应答反应的一种手段。到目前为止,只有一篇文章介绍了蜜蜂体内p450酶活性的诱导效应。苯比巴托、杀螨剂氟胺氰菊酯和甲黎嘧胺可以诱导蜜蜂体内中单氧化酶活性增加。苯巴比妥是一个合成的巴比妥类药物,在多种生物体内可以诱导p450酶活性增加,也是蜜蜂体内p450活性的潜在诱导剂。苯巴比妥可以诱导双翅目、鳞翅目和蜚蠊目昆虫的p450酶活性提高。可以在实验室条件下采用农药代谢分析方法或者是以农药毒性为指标的活性测定方法来测定p450酶活性的诱导效应。尽管苯巴比妥可以诱导许多昆虫体内p450酶活性增加,但是,在膜翅目昆虫中只做过一个苯巴比妥的研究,苜蓿切叶蜂饲喂苯巴比妥,其对胺甲萘的毒性和代谢不受影响。对于许多昆虫,苯巴比妥在诱导p450酶活性增加的同时,也可以诱导p450基因的转录,实验证实它可以诱导双翅目和鳞翅目昆虫中p450中cyp6、cyp4、cyp9家族的转录。饲喂苯巴比妥后,利用微芯片技术检测到苯巴比妥诱导了果蝇体内29个p450基因的表达。到目前为止,还没有饲喂苯巴比妥可以诱导蜜蜂或者其他膜翅目昆虫的p450基因的表达的报道。蜜蜂在花粉、花蜜和蜂胶中遇到的天然植物化学物质也可能是p450解毒的诱导因子。事实上,蜂蜜是人体内p450的有效诱导剂,尽管目前还没有鉴定出蜂蜜中哪个特有成分诱导了p450的活性,但是人取食蜂蜜后,p450酶活性明显提高。类黄酮化合物在植物抗虫性方面具有重要作用,它在花粉和花蜜中都存在,可能会诱导蜜蜂体内p450酶。槲皮素是植物叶子内的一种常见类黄酮,与花粉和花蜜中的类黄酮一样,鳞翅目幼虫取食槲皮素后,p450基因的表达增加,p450对一些标准底物的酶活性也得到提高。蜂胶是蜜蜂采集的一种树脂,主要用于密封结构和抗生素,富含类黄酮化合物和酚类化合物,能够诱导霉菌毒素降解过程中的p450表达。不存在于花粉、花蜜和蜂胶中的一些植物化学物质,是一些植食性昆虫中p450调节的代谢途径的诱导物。和吲哚甲醇(十字花科植物产生的芥子油苷毒素的一种衍生物)和水杨酸(植物抵御昆虫取食时产生的一种独特的植物激素)一样,花椒毒素和种植的伞形科和芸香科植物产生的香豆素是多数鳞翅目昆虫中有效的p450诱导剂。在确认化学物质能够诱导其他一些生物体p450酶表达的基础上,可以用2种方法测定蜜蜂体内p450的诱导效应,一种方法是通过测定蜜蜂对毒性物质的耐药性大小确定化学物质是否对p450具有诱导效应;第2种方法是当有潜在诱导物存在时,测定p450基因转录的变化。在毒性测定中,测定了公认的诱导物对一种农药LD50的影响,这种农药和P450相关。选择可以被蜜蜂体内的p450酶降解的2种拟除虫菊酯类农药高效氯氟氰菊酯和氟胺氰菊酯,还有2种可以被p450活化的吡虫啉和艾氏剂,使用这种方法来测定其毒性。为了确定这些不能识别的物质是不是p450的诱导物,还进行了一个附加的毒力生物测定。蜂业生产中最常用的是高果糖浆和蔗糖溶液,在这些补充的碳水化合物中不含有田间花粉和花蜜中含有的可能对调节p450的表达具有重要作用的植物次生物质。将这些对氟胺氰菊酯和吡虫啉敏感的成年工蜂分别饲喂蜂蜜、蔗糖和高果糖浆,比较它们之间敏感性的差异。另外,在自然环境中存在可以调节p450的表达的黄曲霉毒素B1时,比较分别饲喂糖浆、蔗糖和高果糖浆对成年工蜂寿命的影响,还对比分析了化学杀虫剂和蜜蜂生活环境中有黄曲霉毒素时的工蜂寿命。利用特殊的蜜蜂微芯片技术分析暴露在苯巴比妥中的蜜蜂以评估苯巴比妥对蜜蜂体内p450转录的影响。为了确定自然界中p450的潜在诱导物,在蜜蜂取食花粉、花蜜和蜂胶后,利用northern杂交分析p450中CYP6AS亚家族的表达情况。毛等人曾证实取食槲皮素后出现了一个新p450基因CYP6AS3来代谢槲皮素,槲皮素是广泛存在于植物花粉、花蜜中的一类黄酮化合物。与寄生蜂金小蜂相比,蜜蜂拓展了p450中CYP6AS亚家族的基因分支,这就说明蜜蜂p450中CYP6AS亚家族中的一些分支可能涉及到包括花粉、花蜜和蜂胶在内的蜜蜂食物中的特殊组分的代谢。4结果4.1营养物对氟胺氰菊酯和花椒毒素的影响在所有的测试诱导物中,只有槲皮素明显降低了蜜蜂对氟胺氰菊酯的毒性(表1)。虽然,前期饲喂吲哚甲醇和水杨酸并没有改变氟胺氰菊酯的毒性,但是前期饲喂苯巴比妥和花椒毒素增加了氟胺氰菊酯的毒性,饲喂苯巴比妥也增加了高效氯氟氰菊酯的毒性,但没有对氟胺氰菊酯毒性增加的多,同时,也增加了艾氏剂及其被p450分解的代谢物狄氏剂的毒性。在研究不同的饲喂物(蔗糖、高果糖浆或蜂蜜)对蜜蜂p450诱导能力的分析中,其中的单向方差分析法表明饲喂不同的营养物对氟胺氰菊酯和吡虫啉的毒性没有明显影响。因此,蜂蜜中很明显没有可以降解或者活化2种农药诱导p450表达的成分。4.2蜜、蔗糖不同处理的成活率利用Kaplan-Meier法分析取食不同的食物后蜜蜂对黄曲霉毒素的敏感性,单独计算每个处理的存活中值。取食蜂蜜、蔗糖或高果糖浆的3个处理的存活中值没有明显差异(表2)。然而,在黄曲霉毒素B1存在时,食用蜂蜜的存活中值明显长于饲喂蔗糖和高果糖浆的存活中值,3个存活中值分别为55.0h、40.9h和47.3h,这些结果表明蜂蜜中存在一种或多种成分提高了蜜蜂对黄曲霉毒素B1的耐药性,也可能是诱导提高p450降解真菌毒素的能力。4.3苯巴比妥对蜜蜂跨膜四蛋白的影响接触苯巴比妥后,只有一个跨膜四蛋白16基因表达存在明显差异,苯巴比妥处理蜜蜂后跨膜四蛋白16基因是对照的1.4倍。没有其他的p450基因或者与和解毒能力相关的其他基因家族参与表达。4.4cyp6as1和cyp6as3的微量元素表达饲喂不同剂量的蜂蜜提取物,有大量CYP6AS3基因表达,适度的CYP6AS1和CYP6AS4表达(如图1)。在空白对照中,这些基因的表达量非常低。CYP6AS10和CYP6AS15的表达量一直很高,这些表达与蜂蜜提取物的活化与否无关。花粉和蜂胶的提取物也可以诱导CYP6AS1和CYP6AS3的微量表达,只有蜂胶可以诱导CYP6AS4,无论花粉提取物浓度的高低都可以诱导这些基因的表达,但是必须有高浓度的蜂胶提取物才可以诱导这些基因的表达。无论蜂胶提取物是否被消化吸收,都可以诱导CYP6AS10和CYP6AS15的高表达。蜂蜜提取物对蜜蜂中肠的影响提取蜜蜂肠道RNA用于微芯片分析,结果发现蜜蜂所取食的自然物质影响肠道形态。与取食蜂蜜的蜜蜂中肠相比,饲喂蔗糖的蜜蜂中肠更易碎,更柔软,更小。为了量化这些差异,采用一种独立的生物测定方法,定量分析取食不同食物对蜜蜂肠道的形态学特性的影响。从统计上看,饲喂蜂蜜提取物比那些饲喂蜂粮的蜜蜂中肠直径大(如图2)。饲喂不经过处理蜂粮的蜜蜂中肠直径小于那些饲喂含有高浓度蜂蜜的蜜蜂,饲喂低浓度蜂蜜的蜜蜂中肠宽度位于两者之间。5蜜蜂对p450酶的耐药能力和残留的分析与苯巴比妥可以诱导其它昆虫体内p450s不同,蜜蜂饲喂苯巴比妥后,p450s和其他解毒基因的表达没有发生变化。而且农药毒性测定中没有发现接触苯巴比妥之后有p450的诱导。苯巴比妥增加了所有农药的毒性,表明它和其他农药竞争p450调节的解毒作用。尽管在其他昆虫中苯巴比妥不能诱导p450解毒,苯巴比妥增加农药毒性以前也没有报道。处理蜜蜂的食物产生了耐药性和毒性的不同反应,这和食物中一些成分诱导p450调节的解毒作用相一致。不含蜂蜜的食物显著降低了蜜蜂对天然黄曲霉毒素B1的耐受能力,也没有对合成药物氟胺氰菊酯和吡虫啉的毒性产生影响。虽然缺少一些酶底物活性测定,这些发现已经表明相对与其他昆虫蜜蜂p450基因的调节更加特殊。这种特殊性主要体现在蜜蜂所取食的食物都是经过它们自己加工处理过的蜂蜜、蜂粮或蜂王浆。当蜜蜂遇到没有与之共同进化的新的外源性物质(如吡虫啉或者蜂巢用药杀螨剂)时,这些外源性物质并不像这些蜂巢中常见的外源性物质一样,可以激活相应的分子通道。尽管蜜蜂对一些化学合成药物具有一定的耐受性,但还有许多对蜜蜂高毒,包括与氟胺氰菊酯相似的拟除虫菊酯类农药。蜜蜂p450酶对这些农药的代谢作用就像一个偶然的分子结构的聚集,而不是应对这些农药的分子进化反应。与其它有机体p450不同,蜜蜂p450酶所降解的黄曲霉毒素B1不具有生物活性,与昆虫适应环境的进化过程相一致。蜂蜜中存在的一些底物可以诱导或者上调p450酶的解毒活性,导致可能会出现一种可能,长期饲喂蔗糖或者高果糖浆可能出现一些意想不到的不好的影响。高果糖浆中的果糖可以转化为有毒性的5-羟甲基糖醛,5-羟甲基糖醛可以导致蜜蜂产生相似痢疾的症状和死亡。这说明饲喂蔗糖和高果糖浆的蜜蜂可能缺乏抵抗力,当蜜蜂接触黄曲霉毒素B1,由于p450酶活性降低,最终对黄曲霉素耐药能力减弱。因为蜜蜂接触环境中不适合的外源性物质时,不具