DNA的复制和修复

1第十二单元DNA的复制和修复DNDN的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自DNRNA然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代1958F.Crick提出中心法则：〔1〕DN分子为模板，合成出一样DN分子的过程。〔2DNN〔3〕mRN为模板，依据三联密码规章，合成对应蛋白质的过程。中心法则提示了生物体内遗传信息的传递方向。DN生物合成有两种方式：DN复制和反转录。DN〔真核细胞器DNA〔线粒体、叶绿体〕病毒〔双链，环状〕。DNA的体外复制：分子克隆。一、DNA的复制〔一〕DNA半保存复制1953年Watso和Crick在提出DN双螺旋构造模型时就推想DN可能依据半保存机制进展DNDNDN分子中有一条链DNA另一条是合成的。1958年MeselsoStahl1NE.coli.DNADN的复制是半保存复制。1963年Cairn.coli.染色体DNA。E.coli.DNA，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将E.coli.DNA转至膜上，枯燥，压感光胶,3H 放出B 粒子，复原银，在光学显微镜下观看。用这种方法证明白大肠杆菌染色体DNA是一个环状分子,并以半保存的形式进展复制0DNA的半保存复制可DNA在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。〔二〕复制起点、单位和方向DNA的复制是在起始阶段进展把握的，一旦复制起始，它就会连续下去直到整个复制子完成复制。复制起点复制起点是以一条链为模板起始DN合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上〔D环复制〕。DN呼吸作用猛烈〔甲醛变性试验〕的区段，即常常开放的区段，富含.T。复制起点的克隆和功能分析一一重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点oriC区1Kb勺重组质2oriC245bp勺根本功能区，携带它的质粒照旧能够自我复2045bp勺根本功能区，而打算拷贝数1Kb之间。96bpDN86%同源性，而且有些亲缘关系较远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的构造可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。复制单位〔Replicon〕GenomIDN；都在一个固定的起点开头复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制(一条链复制后才进展另一条链的复制。DNB,B形复制。DN是线形双链分子，含有很多复制起点，因此是多复制子，每个复制子约有100-200Kbp人体细胞平均每个染色体含有00(个复制子。DNA多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。复制方向复制，形成一个复制叉。DN的复制方向及速度，用低放射性H-脱氧胸苷短期标记，再用高放射性常-脱氧胸苷标记，假设为单向，一侧高，另一侧低。假设为双向，中间低，两侧高。E.coli42CDNA在完成复制后，不再开头的复制过程，25C时复制功又能能恢复。DNA的几种复制方式：直线双向复制：单点，双向，T7;多点，双向，真核染色他NABDNA，单向或双向(E.coli)滚环复制：环状单链DNA0x174DDNA多复制叉复制第一轮复制尚未完成复制起点就开头其次轮的复制在.coli.富养分时，可实行多复制叉复制方式OE.coli.DNA的复制最快可达50Kb/min完全复制需40min富养分时，20mir分裂。而真核染色体要6 8小时。DN复制有关的酶及蛋白质因子30DNM制3(一)DN的聚合反响和聚合酶DN5,-3，3,-5，DN聚合反响必备的条件⑵DNA板(RN模板)⑶引物(DNA、RN或蛋白质)⑷4dNTP⑸Mg+2聚合反响过程及特点3-x磷原子发生亲核攻3,.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DN聚合酶的反响特点：4dNT为底物NT的聚合。3-羟基存在5，-3，DN的性质与模板一样DNDN聚合类型发荚环构造：参与单链)N作为模板和引物，3羟基端回折成引物链。末端延长聚合：参与双链)N作为模板和引物，3”末端突出作为模板。分枝型和切口平移型聚合：参与双链)NA聚合发生在切口或末端单链区。DN作为模板。E.coliDNA聚合酶45E coli.DNApol.(Kornberg酶,400copy/cgll单体酶，Mr109KdZrT40(DN/pol.I，催化活性：5，—3，聚合活性；3，5，外切活性；5，3，外切活性。DNApol.I局部水解可得：大片段〔KlenoW75Kd活性：5，-3，聚合活性、3，-5，外切活性。36Kd活性：5，-3，外切活性〔只作用于双链〕N的碱基配对局部，切除修复〕KlenowDNA3DNcDN其次链；dDN测序。E.coli.DNAPol.11〔100copy/cell〕120Kd催化活性：5，-3，聚合〔活性很低〕；3,-5，外切活性，可能在DNA的修复中起某中作用。E.coli.DNApcffi〔复制酶，10-20copy/c0ll1C22个亚基组成，a、&B三种亚基组成核心酶。DNApol.E是合DNReplicase〕，5，-3,DNADN6个结合位点DN结合位点⑵引物结合位点3-0竝点、反响位点dNT结合位点， ⑸5 3 外切位点〔pol.U没有， ， ⑹3 -5 外切位点〔校正， DN聚合酶DNDN复制中起校正功能。⑴DNa,DN⑵DNBDN损伤的修复中起作用。⑶DN聚合酶丫，从线粒体得到，可能与线粒体DN复制有关。，⑷DN聚合酶S,可合成DN链，有3-5 外切活力〔有校对活性〕，功能与E.coli.DNApol.M相像，是负责DN复制的主要的酶。，〔二〕RN聚合酶〔引发酶〕I细胞内，DN〔DNRNA,弓物酶或RN6-10RNI引物。DNRNAIDN聚合酶要用引物，RN聚合酶不需要引物？⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配；, ,DN5-3校对功能难发挥, 〔三〕I、U、川与“epDN两条链解开。解螺旋酶、IIIII5”-3rep3”-5”方向移动。〔四〕DN旋转酶DNU,可引入负超螺旋，消退复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：III，广泛存在于原核生物和真核生物。IDN区，与转录有关。拓扑异构酶n使DNT布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。〔五〕DN结合蛋白〔SSB复制叉上的解螺旋酶，沿双链〕N前进，产生单链区，大量的单链〕N结合蛋白与单链区结DN不被核酸酶降解。〔六〕DN连接酶〔ligase〕DN上的切口。大肠杆菌连接酶只能在模板上连接〕N缺口。TQNAligase即可连接粘性末端的DNADNAE.coli.和其它细菌的DNAligase以NADNAligaseAT为能源。三、CNAS制的拓扑构造DNA复制时，超螺旋构造和双螺旋构造的解开由DNA拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白协同作用完成。四、DNA勺半不连续复制DN的半不连续复制DN5,-3称滞后链，先延着与复制叉前进方向相反的方向，有-3,方向合成短片段即冈崎片段，随后又Kb-2Kb相当于一个顺反子的大小。真核为10200bpDN的长度。DN复制过程〔E.coli.〕复制的起始DNN引物的过程。、引发体：引物合成酶与各种蛋白质因子〔dnaBdnaGn nzn“I〕构成的复合体，负责RN、引物的合成。5”—3〔方向一样〕，移到确定位置上即可引发引物的合成。710大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:DNaA在原点处翻开双螺旋DNaBDN解旋DNaCDNaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶〔DNaGRN引物SSB结合单链DNARN聚合酶大肠杆菌复制原点起始复制所需蛋白质:DNaA在原点处翻开双螺旋DNaBDN解旋DNaCDNaB结合在原点所需Hu刺激起始引物酶〔DNaGRN引物SSB结合单链DNARN聚合酶DNa活性旋转酶DN扭曲应力20Dna9bp重复区，形成起始复合物，DN13bpt复区依次变性，产生开放型复合物。DnaB〔Dna帮助下〕与开放复合物结合，进一步解链。DN链的延长反响RNRN引物，链的延长DNApol.m催化。DN合成的生长点〔既复制叉上〕分布着很多与复制有关的酶和关心因子，它DN的模板链形成离散的复合物，彼此协作进展高度准确的复制，称为复制体。复制体沿DNARNA^|物的切除及缺口补齐DNApoll5，—3，RN引物。DNApol5，—3，合成活性补齐缺口。DNAU口的连接DNAligase,ATNA哄能。DNA合成的终止DNADNA复制叉相遇即终止。小结：⑴DNADNA⑵SSBDN单链。⑶DNA旋转酶引入负超螺旋，消退复制叉前进时带来的扭曲张力。⑷DNA引物酶〔在引发体中〕RN引物。⑸DNApol.DNA〔6〕DNApollRNDNAmDNAligase连接一个冈崎片段。DNdTTdUT的区分力气高，dUT掺入DN链中，此时，U-糖苷酶、A呐切酶、DNApoll、DNAligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。DN的复制复制起点和单位真核生物染色体DN是多复制子，有多个复制起点，可以多点起始，分段进展复制。每个复制子大多在100 200bp之间，比细菌染色体DNA〔单复制子〕小得多。试验证据：5-氟脱氧胞苷标记试验。DN3Kb5Kb早期胚胎细胞中相邻复制起点的平均距离为.9kb,40kb，成体细胞只利用一局部复制起点。复制过程中组蛋白的装配在真核生物的复制子上，亲代染色体的核小体被逐个翻开，组蛋白以完整的八聚体形式直DNN的复制是半保存的，而组蛋白则是全保存的。试验证据：环己酮亚胺抑制组蛋白合成，电子显微镜下观看。DN复制的终止DN序列与蛋白质形成的一种复合体，是真核细胞染色体末端所特有的构造。其功能为：DN的完整复制⑵保护染色体末端⑶打算细胞寿命，胚系细胞含端粒酶，体细胞不表达端粒酶。端粒(telomeres1OObp5，(TxGyn3(AxCy)n,xy—般为1〜4。，端粒末端的重复序列，通过端粒酶(telomerase)将其加到染色体末端。端粒酶含有RNA和DN聚合酶的作用)两种组分，RN159bCyA重复序列，RN端粒TxGN模板互补的DN片段。50-200bp，1〜4KbP寸，细胞就停顿分裂。假设能重建端粒，则细胞可以永久分裂。恶性肿瘤细胞端酶表达增多。DNAT制的调控DNA复制的调控与其生长环境有关，但其调控的机制有待深入争论。真核生物DNA复制的调控与细胞周期蛋白等多种蛋白质因子有关其机制格外简洁，目前已取得不少研10究成果，但尚有很多问题需进一步争论解决。DN复制的真实性DN07〜10碱基对,只有一个错误碱基。碱基对的自由能通常在4〜13KJ/mo,这样的自由能相当于平均参入10(个核苷酸就可能消灭Watson-Crick02。DN/聚合酶对碱基的选择作用NT合。DNNT掺入引物末端。酶乐观参与理论:DN聚合酶对正确与错误的核苷酸，不仅亲和性不同，而且将它们插入DNA引物端的速度也不同。NT结合在酶与模板一引物复合物的聚合位点上，DNJNTPDNDNDN模板一引物,另一种是dNTPDN聚合酶先识别DN3,dNTP是一种有序的识别过程。3，5,外切活性的校正阅读E.coli.DNApol.Ipol.m3-5,外切活性，可删除错误插入的核苷酸。， 缺失3，-5,外切活性的E.coli.DN/pol.I，催化DN合成时，消灭错误的几率增巌-50倍。因此，3 -5外切活性可以使DN复制的真实性，提高〜2， DNA合成真实性的因素,⑴高浓度3-/皿卩,5-GMP)NMdNT结合位点，抑制®—5外切活性。,dNT浓度银高,3,末端离开外切活性中心。©dNTP-般与二价阳离子结合成活化形式,Mg+11M®代替Mg+时，会转变酶的主体构造，影响聚合活性和，—3外切活性。RN引物⑴从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配。⑵复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链,DN5,—3,校对功能难发挥作用。七、DNA勺损伤及修复4DN然而在确定条件下，生物机体能使这种损伤得到修复。紫外线可使DN分子中同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶碱基之间形成二聚体TT，两个T以共价键形成环丁烷构造。CTCC间也可形成少量二聚体(CTCC,使复制、转录受阻。细胞内具有一系列起修复作用的酶系统可以除TDN 上的损伤恢复DN的双螺旋构造。目前有4种酶修复系统：光复活、切除修复、重组修复S0反响诱导的修复，后三种不需要光，又称为暗修复。直接修复194400nm形成的嘧啶二聚体。高等哺乳动物没有此酶。切除修复在一系列酶的作用下，将DN分子中受损伤局部切除，并以完整的那一条链为模板,合成出切去局部，DN恢复正常构造。构造缺陷的修复：DN损伤部位，在其四周将其切开。核酸外切酶切除损伤的DNADN聚合酶修复。1213DN连接酶连接。4.----------------------N-糖苷酶〕：甲基磺酸甲酯可使鸟嘌呤第位氮原子烷基化，活化B-糖苷键，造成脱嘌呤作用；酸也能使DN脱嘌呤。DN复制时，DNdTTdUT区分力不高，有少量dUTDN链。细胞中的尿嘧啶-N-糖苷酶可以切掉尿嘧啶。腺嘌呤脱氨形成次黄嘌呤时也可以被次黄嘌啾-糖苷酶切掉次AP核酸内切酶切开，核酸外切酶切除,DN聚合酶修复，DN连接酶连接。插入酶插入正确碱基重组修复DNDN发动复制时尚未修复的损伤部位，可以先复制，在重组修复过程中，DN链的损伤并未除去。4recA40000勺蛋白质，它具DN重组和重组修复中均起关键作用°recB、recC基VN聚合酶和连接酶。易错修复和应急反响〔SO反响〕DNDN复制系统受到抑制的紧急状况下，为求得生存而SO反响诱导的修复系统包括避开过失的修复〔无过失修复〕和倾向过失的修复。避开过失的修复:SO反响能诱导光复活切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，从而加强光复活切除修复和重组修复的力气，这属于避开过失的修复。倾向过失的修复:SO反响还能诱导产生缺乏校对功能的〕NDN损伤部位进行复制而避开了死亡，可是却带来了高的突变率，这属于倾向过失的修复。SORecLexASRecA白不仅在同源重组中起重要作用，而且它也是SO反响的最初发动因子。在有单链DNAT存在时，Rec蛋白被激活而表现LexAt白。LexAS白〔22Kd很多基因Rec的蛋白水解酶分解后就可以使一系列基因得到表达其中包括紫外线损伤的修复基因uvrA、uvrBuvrC〔分别编码核酸内切酶的亚基〕ecAlexA基因本身，ssb,DNhimA与诱变作用有关的基因jmuD,CsulA,ruvon，以及一些功能不清楚的基因iinA,B,D,F等。SO反响广泛存在于原核生物和真核生物它是生物在极为不利的环境中求得生存的一种基本功能。SO50反响的作用剂通常都具有致癌作O反响，5-溴尿嘧啶。目前，有关致癌物的一些简便检测方法就是根擴O反响原理而设计的，既测定SO反响。八、RNADN合成〔反转录〕反转录〔reversetranscription〕RN为模板，合成DNA与通常转录过程中遗传信息流DNRN的方向相反。197〔年，TeminBaltimoreRN病毒〔劳氏肉瘤病毒和鼠白血病病毒〕中觉察RN病毒是一大类能引起鸟类、哺乳类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。经过改造后可以作为基因治疗的载体。D〔DN为模板的反响，复制和转录〕RN病毒的复制，可见致癌RNDNABader用嘌呤霉素(puromycin肉瘤病毒(RSV,证明反转录酶是由反转录病毒带入细胞的，而不是感染后在宿主细胞中合成的。aB亚基组成，含有ZrT,具有三种酶活力。RNDNRN为模板，合成一条互补的DNARN—DN杂种”RNaseRN—DNRNA3—55—3两个方向起外”切酶作用。DNDN聚合酶活力。模板：RNDNARN为模板时，该酶的反转录活力最大，但是带有适当引物的任何种类的RNDN的模板。I物：RNDNA底物：dNTP二价阳离子：MgMn+mRNApolyAoligodTDNARN的反转录过程RN病毒都含有反转录酶，因此被称为反转录病毒retrovirus)，反转录病4DN中间体(前病毒)。1反转录病毒的基因组构造反转录病毒基因组通常由两条一样的+)RN链组成。5”端四周区域以氢键结合在7~10KbRN链的两端具有一样的序列，形成正向重复序列。5”端有帽子构造，3”polyAmRNA似。51tRNAtRNAPtRNA°反转录过程。RNRNDNA其过程为：以病毒〔+〕RN为模板，合成互补的〔〕DNARN—DNRNA以〔-〕DN链为模板，合成〔+〕DNM，最终形成两端带有LTR〔长末端重复序列〕DNAN后才能被转录，转录产物经拼接可以产生不mRNA_TR〔长末端重复序列〕DNDN以及整合后的转录均起着重要作用。反转录病毒合成的过程缺口的模板〔基因组〕RNAUDNRN的引物，而其余的模板RNADN合成开头，复制。反转录病毒的生活周期病毒粒子侵染细胞，病毒和反转录酶一起进入细胞。RNDN〔前病毒〕，环化，进入细胞核。DNDN中。DNN和病毒蛋白。RN和病毒蛋白在胞质中组装成病毒粒子，转移到质膜，通过出芽方式反转录的生物学意义。RNRN病毒引起细胞恶性转化有关。艾滋病毒(AIDS即人类免疫缺陷病毒(HIV,也是一种反转录病毒主要感「 淋巴细4BlOOnm球状，粒子外包被两层脂质质膜，膜上有糖蛋白(gp12Qgp41)324p1&HIVN组成，每个链长9.7kb,RNA5端有帽子构造，3PolyA,链上结合有反转录酶。DN等成分，与反转录病毒有明显的区分。真核生物正常细胞内也存在反转录过程真核生物的