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文档简介

单克隆抗体的标记（酶标记、荧光素标记、同位素标记和生物素标记）目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。一、酶标记1、辣根过氧化物酶（HRP）标记辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。程序一：（1） 将5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中；^口0.5ml10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。（2） 加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混匀。（3）加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。（4）称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4°C过夜。（5） 用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4C过夜）。（6） 将交联物过SephadexG200或Sepharose6B（2.6X50cm）层析纯化，分管收集第一峰。（7） 酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量（mg/ml）=OD403X0.4IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403X0.3）X0.62克分子比值（E/P）=酶量X4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20°C存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4C保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。程序二：将5mgHRP溶于0.3mol/LPH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的a和e氨基。再加1ml0.06mol/L

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