基因工程抗体

基因工程抗体第1页，课件共41页，创作于2023年2月单克隆抗体用于治疗存在的问题

1、单克隆抗体的特异性由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应；

2、异种抗体反应鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应第2页，课件共41页，创作于2023年2月理想的抗体药物的性质高特异性和高亲和力（Kd=108~1010L/M）对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应游离抗体不激活补体一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行大规模培养抗体符合生物制品标准第3页，课件共41页，创作于2023年2月

问题异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果靶部位摄取的量太低效应功能弱在体内被清除速度快

对策抗体人源化改变抗体分子大小连接毒素、放射性同位素、药物抗体人源化抗体治疗存在的问题及对策第4页，课件共41页，创作于2023年2月抗体药物改造的方向抗体人源化和人源抗体制备改变抗体分子大小增强抗体亲和力增强抗体效应功能第5页，课件共41页，创作于2023年2月单克隆抗体人源化的改进鼠抗体人源化（人-鼠嵌合、改型抗体）小分子抗体（Fab、单链、单域、超变区多肽）基因工程抗体（双特异、免疫黏连素、催化抗体）人源抗体（噬菌体抗体库、转基因小鼠）人-人抗体第6页，课件共41页，创作于2023年2月

1、抗体人源化鼠单克隆抗体人源化：嵌合抗体、改型抗体小分子抗体：单价(Fab、ScFv、单域抗体、超变区多肽)、多价（Di-,Tri-,Minibody）特殊类型抗体(双特异性抗体、细胞内抗体、抗原化抗体、免疫脂质体)抗体融合蛋白（免疫粘连素、免疫毒素、催化抗体）

第7页，课件共41页，创作于2023年2月VH和VL是抗原决定簇结合位点高变区HVR决定簇互补区CDR

骨架区FRCH1和CL：Ig同种异型的遗传标志CH2：补体结合位点CH3：某些细胞Fc受体结合部位

第8页，课件共41页，创作于2023年2月

第一代的抗体人源化—嵌合抗体

从杂交瘤细胞分离出鼠MAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌合抗体由于这两部分在空间结构上相对独立，其独特的抗体亲和力保持得很好，但因鼠单抗可变区的存在，应用时仍有较强的免疫排斥反应。

特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。第9页，课件共41页，创作于2023年2月Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略第10页，课件共41页，创作于2023年2月鼠VH鼠VL人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体第11页，课件共41页，创作于2023年2月第二代的抗体人源化——改型抗体

在嵌合抗体的基础上进一步将鼠MAb可变区中相对保守的FR(frameworkregion)替换成人的FR，保留与抗原结合部位决定簇互补区（complementdeterminantregion)部位(即CDR移植)

早期的改型抗体：简单的CDR移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。第12页，课件共41页，创作于2023年2月第二代改型抗体：①应用了人抗体基因库；②引进计算机技术模拟抗体分子的立体结构(分子模拟法)；③使用了鼠人嵌合FR。其目的是获得具有高亲和力的治疗性抗体

第13页，课件共41页，创作于2023年2月CDR序列CDR序列鼠单克隆抗体人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化（CDR移植）第14页，课件共41页，创作于2023年2月

小分子抗体

人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体两种。第15页，课件共41页，创作于2023年2月单价小分子抗体一、Fab抗体

Fab段由重链V区及CH1功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。Fab抗体只有完整IgG的1/3。第16页，课件共41页，创作于2023年2月二、单链抗体(ScFv)

定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。Ag第17页，课件共41页，创作于2023年2月

ScFv应用：用于肿瘤的导向治疗肿瘤的影像分布基因治疗研究基因结构与功能的关系第18页，课件共41页，创作于2023年2月三、单域抗体

抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的1／12，故也称之为小抗体。第19页，课件共41页，创作于2023年2月四.超变区多肽(hypervariableregionpolypeptides)

抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimalrecognitionunit,MRU)。第20页，课件共41页，创作于2023年2月

多价小分子抗体在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。其中包括双链抗体(diabody)，微型抗体（minibody），三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等。

第21页，课件共41页，创作于2023年2月AgAg一、双链抗体(diabody)

制备方法化学交联法粘性蛋白结构域融合法接头长度控制法。第22页，课件共41页，创作于2023年2月二、三链抗体(triabody)

在制备单链抗体时，当接头的长度为2个或2个的以下氨基酸残基时，或者直接把VH结构域的N末端与VL结构域的C末端相连，通过非共价键而形成的三聚体，称为三链抗体。接头长度在3～12个氨基酸残基时，则形成双链抗体。第23页，课件共41页，创作于2023年2月三、微型抗体(minibody)

通过基因工程手段采用不同的接头把单链抗体(VL-VH)的VH结构域与IgG的CH3结构域融合，形成VL-VH-CH3的结构，称之为微型抗体（minibody）。此种抗体合成后通过CH3结构域形成稳定二聚体式，发挥其双价微抗作用。第24页，课件共41页，创作于2023年2月四、双特异性抗体（BfAb）天然Ig是由两个完全相同的VL和VH区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的关键部位。而经人工设计构建的双特异性抗体（BsAb）则由两个不同的抗原结合位点组成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药物、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种具有双价双特异性的抗体又称为双功能抗体（bifunctionalantibody,BfAb）第25页，课件共41页，创作于2023年2月双特异性抗体的特点将免疫细胞锚着于肿瘤部位，提高肿瘤部位的效靶比。不受MHC的限制，直接激活免疫细胞的杀瘤机制。第26页，课件共41页，创作于2023年2月123第27页，课件共41页，创作于2023年2月提高抗体效应功能抗体融合蛋白双特异性抗体偶连细胞毒物质细胞内抗体提高抗体效应功能第28页，课件共41页，创作于2023年2月抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：Fc融合蛋白（Fcfusionprotein,FcFP）由抗体的Fc段与某些具有特定功能的蛋白结构域融合而成。如CD4免疫粘附素，就是由抗体的Fc段与2个CD4分子的Ig同源区重组而成抗原结合融合蛋白（antigen-Bindingfusionprotein,ABFP）由具有抗原结合功能的抗体结构与其他功能性蛋白融合构成。如免疫毒素，抗体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。第29页，课件共41页，创作于2023年2月

免疫粘附素(immunoadhension)：将人抗体恒定区(主要是Fc段)N-端连接于人细胞表面的受体分子或细胞粘附分子上，在真核细胞中表达出正确折叠的融合抗体蛋白分子，这种分子可同时发挥抗体的效应功能及其它相应的效应功能，这种分子又被称为新效能抗体。

免疫毒素：又称生物导弹，是由导向性的载体分子与具有毒性的弹头蛋白交联而制成，属于导向药物的一种。第30页，课件共41页，创作于2023年2月偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）第31页，课件共41页，创作于2023年2月免疫毒素CCVCVCCCSPDPSPDPRicinARicinA（α-FcγRI-RicinA）RicinA:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用第32页，课件共41页，创作于2023年2月CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2

免疫细胞因子(Immunocytokine)第33页，课件共41页，创作于2023年2月

五、细胞内抗体

细胞内抗体主要是指在细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体，亦称内抗体（intrabody）。目前的研究主要集中在单链抗体上，在ScFv的C端或N端插入其它靶向信号（targetingsignals），如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号和内质网滞留信号等，从而进行检测、识别、发挥特定功能。第34页，课件共41页，创作于2023年2月细胞内抗体的应用：由于细胞内抗体具有高亲和力及选择结合特性，因而可通过多种机制调控细胞的生理过程及代谢。作用机理表现为：阻断靶蛋白的活性部位阻断细胞内蛋白－蛋白相互作用干扰细胞内靶蛋白的转运促使靶蛋白降解第35页，课件共41页，创作于2023年2月六、抗原化抗体（antigenizedantibody,AbAg）

AbAg是应用基因工程技术，把编码蛋白质抗原表位的核苷酸片段插入重链CDR3序列中进行表达，从而产生具有天然抗原表位构象和免疫原性的新型抗体。第36页，课件共41页，创作于2023年2月今后抗体药物发展的方向寻找新的靶抗原基于抗原立体结构设计抗体基于抗原-抗体相互作用设计小分子抗体模拟物第37页，课件共41页，创作于2023年2月最理想的单克隆抗体100%人源人类免疫系统自然产生第38页，课件共41页，创作于2023年2月25年来的全人抗体的尝试鼠骨髓瘤不适合与人B细胞融合稳定性差抗体产量低非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)保存抗体分泌细胞细胞株不稳定抗体的产量低不能特异性地保存抗体分泌细胞很难获得人类骨髓瘤细胞株第39页，课件共41页，创作于2023年2月成功建立人骨髓瘤细胞系，人源抗体进入新的里程用途：能稳定的保持人B细