基因工程抗体及其发展前景

基因工程抗体及其发展前景第1页，课件共74页，创作于2023年2月主要内容第一节:基因工程抗体的基本原理：第二节:人源化抗体制备的主要方法：第三节:抗体靶向治疗的新的思考：第四节:工程抗体的未来发展与展望：第2页，课件共74页，创作于2023年2月第一节：基因工程抗体的基本原理

(antibodyengineering）第3页，课件共74页，创作于2023年2月Antibodyhasahigherspecificityandaffinitytobindtotargetprotein.

药物(drug)：是一类分子（化学合成物，蛋白质，核酸等）可以干扰人体内细胞生命过程中一些重要的生理和病理活动或通路。第4页，课件共74页，创作于2023年2月基因抗体：通过基因工程手段，保留抗体重轻链可变区中主要与抗原结合的CDR功能区,而形成的各种功能抗体．Complementary-determiningregions:CDR第5页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程抗体的分类第6页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程抗体的分类2.小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（singlechainantibody，scFv）、双链抗体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）第7页，课件共74页，创作于2023年2月抗体药物在应用中存在的问题：一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可减少异源性蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到限制，而影响疗效。问题:工程细胞系,大规模生产工艺技术第8页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。第9页，课件共74页，创作于2023年2月目的：减小鼠源性成份，降低HAMS反应（humanagainstmousesyndrome)。易于大规模生产和应用于临床。保留抗体的抗原结合能力。基本原理：借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。第10页，课件共74页，创作于2023年2月基因工程抗体的表达原核细胞和酵母可以用于表达小分子抗体和抗体片段大部分完整抗体和双链抗体、微型抗体等需要在CHO等哺乳动物细胞中表达利用完整的动植物体通过转基因的方法表达外源蛋白：如利用转基因烟草生产抗狂犬病毒抗体第11页，课件共74页，创作于2023年2月抗体工程的发展历程动物多克隆抗血清被抗生素所代替成份复杂，副反应严重鼠源单克隆抗体1975年，杂交瘤技术制备单抗成功“魔弹”HAMA反应20世纪90年代初，抗内毒素单抗用于治疗脓毒败血症遭遇失败。抗体药物的研究进入低谷。分子生物学基因工程技术基因工程抗体鼠源抗体的人源化及形式多样的改造抗体抗体工程就是指利用分子生物学、基因工程等手段对抗体进行各种不同的改造并在原核、真核细胞中表达制备的工程技术。马血清,破伤风,狂犬病第12页，课件共74页，创作于2023年2月TheEvolutionofTherapeuticAntibodiesMurineFullyHumanHumanizedChimeric100%mouseprotein34%mouseprotein5-10%mouseprotein100%humanproteinPotentialforImmunogenicityHighLowLonbergN.NatBiotechnol.2005;23:1117-1125.TernantD,etal.ExpertOpinBiolTher.2005;5(Suppl1):S37-S47.

YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.WeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9..嵌合抗体人源化抗体全人抗体第13页，课件共74页，创作于2023年2月第14页，课件共74页，创作于2023年2月第二节：基因工程抗体制备的主要方法：第15页，课件共74页，创作于2023年2月1.人鼠嵌合抗体

（ChimericAntibodies）原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持抗体与原抗原的特异性结合。缺点：鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过敏反应（HAMS反应，humanagainstmousesyndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。第16页，课件共74页，创作于2023年2月Chimericantibodies杂交瘤细胞株获得两个可变区克隆载体(T载体)原核表达系统检测构建表达载体RT-PCR酶切测序酶切，连接转化是是否否酶切，连接1。获得鼠单抗重轻链可

变区的基因片段。2.基因片段插入含有人IgG重轻链恒定区的表达载体。第17页，课件共74页，创作于2023年2月人鼠嵌合抗体的真核表达在CHO细胞（共转染模式和单载体转染模式）

第18页，课件共74页，创作于2023年2月Until2003,7，8437peoplehavebeeninfectedwithSARSoverthe32countries,inwhich813patientswerediedformdisease.Thediseaseincidenceisabout10.5%.Therearemanyunresolvedquestionsaboutdiseasepathogenesis,treatmentanddiagnosis.第19页，课件共74页，创作于2023年2月2.humanizedantibodies"Humanization"or"reshaping"ofmurineantibodiesisanattempttotransferthefullantigenspecificityandbindingavidityofmurinemonoclonalantibodiestoahumanantibodybygraftingthemurinecomplementaritydeterminingregions(CDRs)ontoahumanvariableregionframework。保留鼠CDR的人源化Ab65to90%第20页，课件共74页，创作于2023年2月MouseHumanHumanisedhypervariableframework第21页，课件共74页，创作于2023年2月humanization-CDRgrafting

CDRresiduesfromvariableregionofamousemAbaretransferredtohumanantibodyframeworksthathavehighsequencehomologywiththemousecounterparts第22页，课件共74页，创作于2023年2月HumanizedAntibodiesAllowsspecificityAllowseffectorfunctionsLessimmunogenic第23页，课件共74页，创作于2023年2月humanization-advantageMurinemAbshavebeenextensivelycharacterizedandhavedesirableantiviralpropertiesand/orsuperiorfullyhumanmAbsarehardtoobtain.Thisviableapproachistheclassicandsimpleststrategy

ofhumanizationamongmanyotheravailablestrategies,suchasgraftingspecificitydeterminingresidues17.ThefactthatnearlyhalfofallUSFoodandDrugAdministration

(FDA)-approvedtherapeuticmAbsarehumanizedantibodiestestifiestotheirsafetyandtolerancebyhumans.第24页，课件共74页，创作于2023年2月3。FullyhumanmAbs

1）。transgenicmice2）。Humanantibody-displaylibraries3）。TomakeHumanmAbfromhumanbeing全人抗体100%第25页，课件共74页，创作于2023年2月1）Transgenicmice首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。第26页，课件共74页，创作于2023年2月CreationofFullyHumanmAbsFromTransgenicMiceReplacemurineimmunoglobulin(Ig)GgeneswithhumanIgGgenesWeinerLM.JImmunother.2006;29:1-9.YangX-D,etal.CritRevOncolHematol.2001;38:17-23.MousestrainincapableofproducingmouseantibodiesHumanIglociBreedingBreedingMouseembryonicstemcellscontaininghumanantibodygenesMousestrainproducinghumanandmouseantibodiesMouseembryonicstemcellswithinactivatedmouseheavyandlightchainlociMouseIglociMousestrainproducingonlyhumanantibodies第27页，课件共74页，创作于2023年2月Transgenicmouse-advantageHavearepertoireoffullyhumanIgG1gaveresearchersanalternativeroutetohumanmAbsthroughactiveimmunization,withouttheprotocolrestrictionsassociatedwithhumanstudies.第28页，课件共74页，创作于2023年2月Transgenicmouse-drawbacksAstheimmuneresponseintransgenicmiceissometimeslessrobustthaninstrainsthatareusedtogeneratemousemAbs,moreimmunizationsorantibodyscreensareoften

required.Thesetransgenicmicecannotexactlyreproducethehumanantibodyresponsebecauseofrepertoiredifferencesandbecausethegeneticbackgroundofthemurinehostaffectsantigenprocessing,B-cellontologyandregulation(e.g.,tolerancemechanisms).Atpresent,thesetransgenicmiceareprotectedintellectualpropertyandthereforenotcommonlyavailable第29页，课件共74页，创作于2023年2月2）噬菌体抗体库技术

(Phageantibodylibrarytechnique)把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在l噬菌体表面,组成抗体库。通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。第30页，课件共74页，创作于2023年2月scFv---single-chainvariablefragments第31页，课件共74页，创作于2023年2月Displaytechnologies-strategy第32页，课件共74页，创作于2023年2月PhageDisplayLibrary-Antibodylibrary-fromImmunologyToday(2000),21,371-378第33页，课件共74页，创作于2023年2月FlowchartofPhageDisplayApplicationDisplayingTargetsonFilamentousPhagePanning(Selection)ofThePhageLibraryExpressiontheProteinFragmentorIsolationofAffinity-PurifiedPhageClonesLibraryclonesExpressionIsolation第34页，课件共74页，创作于2023年2月StartfromhumangenesNewspecificities?Lessimmunogenic?CanscreenalargerrepertoireLossofcombinatorialspecificitiesBypassimmunisation–naivelibraryLowaffinityAffinitymaturationinvitroExtrasteps,moreimmunogenic?Economicalproductioninbacteria

OnlyfragmentsPhageDisplay-advantages第35页，课件共74页，创作于2023年2月PhageDisplay-drawbackUnnaturalpairingsoftheantibodyheavyandlightchaincomponentsThemethodofpresentationofantigenasbaitforpanningmayaffectthenumberanddistributionofavailableneutralizingepitopes.第36页，课件共74页，创作于2023年2月NaïveorimmunizedKeypointFunctionalAb第37页，课件共74页，创作于2023年2月3）用人的骨髓瘤细胞直接制备

全人抗体关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。稳定性高和融合率高。(Humanantibodies2002,11:85-96)第38页，课件共74页，创作于2023年2月MousemyelomaHumanmyelomaDoubleselectingmarkers

G418andHATHumanLNBcells第39页，课件共74页，创作于2023年2月BreastcancertissueBreastcancercellsWeworkonHCV/E2mAbandRabbisvirusSproteinbyusingFMP2cells.第40页，课件共74页，创作于2023年2月4.B细胞永生化技术：用EB病毒将人淋巴细胞永生化可产生分泌抗体的B细胞克隆。这一技术较为成熟，但是存在抗体分泌不稳定的缺点，限制了其应用。或直接分离分泌抗体的B细胞,用PCR获得重轻连,构建全人抗体.第41页，课件共74页，创作于2023年2月Bcellimmortalization:EBVTransformationEpstein-BarrvirusWhenEBVinfectsB-lymphocytesinvitro,lymphoblastoidcelllineseventuallyemergethatarecapableofindefinitegrowth.Thegrowthtransformationofthesecelllinesistheconsequenceofviralproteinexpression.第42页，课件共74页，创作于2023年2月BcellimmortalizationMemoryB-cellsareobtainedfromthebloodofanindividualrecoveringfromavirusinfection.Therebyobviatingtheneedforafusionsteptogeneratehybridcells,asinthehybridomatechnique.第43页，课件共74页，创作于2023年2月MemoryB-cellimmortalizationMemoryBcellsisolatedfromPBMCImmortalizedbyEBVinthepresenceofaCpGoligodeoxynucleotideandirradiatedallogeneicPBMCs第44页，课件共74页，创作于2023年2月RelatedpaperMemoryB-cellsisolatedfromthebloodofindividualswhohaverecoveredfromSARS-CoVandH5N1avianinfluenzainfectionshavebeenimmortalizedusingthismethodtoproduce

nAbsagainsttheseviruses.Traggiai,E.etal.AnefficientmethodtomakehumanmonoclonalantibodiesfrommemoryBcells:potentneutralizationofSARScoronavirus.

Nat.Med.10,871–875(2004).Simmons,C.P.etal.ProphylacticandtherapeuticefficacyofhumanmonoclonalantibodiesagainstH5N1influenza.PLoSMed.4,178(2007).第45页，课件共74页，创作于2023年2月５．SingleBcellRT-PCRNatureBiotechnology,2008,26:886-887.第46页，课件共74页，创作于2023年2月thestrategyofsinglecellRT-PCR第47页，课件共74页，创作于2023年2月Thetimeframe-onemonth第48页，课件共74页，创作于2023年2月各种全人抗体生产技术比较优点缺点微生物表面展示技术很成熟，体外进行抗体亲和力的完善，抗体的重轻链不是天然配对，没有在体外还原天然抗体的构象转基因小鼠可以产生全人免疫球蛋白库，不受到人体试验的限制转基因老鼠还是并不能生产精确的全人抗体EBV病毒转化EBV病毒转化产生的B细胞杂交瘤用于产生中和抗体，材料来源广泛B细胞杂交瘤存在染色体不稳定，易丢失的缺陷单个B细胞RT-PCR方便，常规分子克隆实验条件快速，条件优化后仅需要30天高通量，针对抗原特异抗体库亲和力和特异性：亲和力很高，获得针对抗原各表位的抗体适用通过疫苗治疗的各种疾病慢期炎症或致死性病原体如HIV，癌症和自身免疫病方面应用受到限制第49页，课件共74页，创作于2023年2月Sourceofantibodiesonthemarket

(accordingtoa“marketanalyst”)SourceAntigenicity%HumanMouse+++0%Chimeric+60-70%Humanised->90%Human-100%第50页，课件共74页，创作于2023年2月第三节：抗体靶向治疗的新思考问题1：在临床上抗体用量大（几百毫克到克级），价格昂贵。在不发达国家难于承受。问题2：由于专利限制，中国难于进行metoo药仿制。解决方案：能否利用中和性抗体的靶向作用，确定抗体作用的靶点位子，用小分子替代，设计新药？第51页，课件共74页，创作于2023年2月SinceaneutralizedmAbisvaluableindiseasetreatment,thetechniquesusedhereallowustoidentifycorefunctionalregionsofgivenreceptor/ligand.therefore,thereisapotentialtodesignrationalmimickingmoleculesbasedontheidentifiedregion.DefiningthefunctionalregionofligandorreceptorrecognizedbyneutralizingmAbwillbeessentialinidentifyingnoveldrugtargets.Prospective展望第52页，课件共74页，创作于2023年2月抗体药物发展现状FDA已批准上市的抗体药物SFDA(中国)已批准上市及临床研究的的抗体药物第53页，课件共74页，创作于2023年2月第54页，课件共74页，创作于2023年2月第55页，课件共74页，创作于2023年2月第四节：工程抗体的未来发展与展望1.单克隆抗体的市场需求第56页，课件共74页，创作于2023年2月

对2004—2011年全球治疗单抗市场的预测及分析第57页，课件共74页，创作于2023年2月2.抗体药物的应用领域抗器官移植排斥反应；肿瘤导向治疗；哮喘、银屑病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病；心脑血管疾病；感染性疾病；其他第58页，课件共74页，创作于2023年2月四种抗体的临床应用概况第59页，课件共74页，创作于2023年2月第60页，课件共74页，创作于2023年2月第61页，课件共74页，创作于2023年2月第62页，课件共