多肽adwx-1在大鼠体内的药动态变化

多肽adwx-1在大鼠体内的药动态变化

类风湿性关节炎（ra）是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身免疫性疾病。主要临床表现为关节早僵硬、疼痛、肿胀和障碍。近年的研究表明T细胞表面钾通道Kv1.3是治疗T细胞介导自身免疫性疾病的药物靶标,钾通道Kv1.3调制剂特别是动物毒素多肽可以治疗多发性硬化症、Ⅰ型糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、延迟型过敏反应蝎活性多肽ADWX-1是我国创新设计靶向T细胞钾离子通道Kv1.3的治疗风湿性关节炎多肽类候选药物,分子质量为3.9k,作用于钾通道Kv1.3的活性为1.8pM。它是目前公开报道作用钾通道Kv1.3选择性最强的多肽(作用钾通道Kv1.1的IC本研究使用氯胺-T法将SD大鼠皮下单次给予不同剂量的ADWX-1后大鼠血浆中ADWX-1浓度,应用DAS软件处理,进行药代动力学参数分析,为进一步研究奠定基础。11.1材料表面1.1.1主要试剂ADWX-1多肽,冻干粉,纯度>99.0%(批号:20091218(4-1)、20091218(4-2)),上海新生源医药研究有限公司提供;1.1.2动物SD大鼠,清洁级,雌雄各半,体重220±20g,购自浙江省实验动物中心,合格证号:SCXK(浙)20080033。1.1.3碘化钾ki三氯乙酸(TCA),江苏永华精细化学品有限公司;肝素,上海蓝季科技发展有限公司,批号:090725;碘化钾(KI),分析纯,南京化学试剂有限公司;牛血清白蛋白(BSA),上海惠兴生化试剂有限公司,批号:070108;0.9%氯化钠注射液,四川科伦药业股份有限公司,批号:L1091016B;空白大鼠血浆,自制。1.1.4仪器SN-695B型智能放免γ测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂,对1.2实验方法1.2.1adwx-1生物活性检测I-ADWX-1的放射化学纯度测定将I-ADWX-1的生物活性测定由武汉大学生命科学院用全细胞膜片钳法测定,在相同条件下比较1nmol/LADWX-1与1.2.2标准曲线、稳定性和准确度测定方法:精密移取待测样品(质控)溶液100μL,置于放免管中(各浓度均复管测量),使用SN-695Bγ测量仪测定各管的放射性计数60s;再向以上各管中加入等体积20%三氯乙酸(TCA),涡旋45s,4000r/min离心15min,弃上清,沉淀再用SN-695Bγ测量仪测定各管的放射性计数60s。标准曲线及测量范围:精密称取多肽ADWX-1适量,用0.9%NaCl注射液配置成25μg/mL(其中含精密移取A液100μL与900μL空白血浆混合,定容至1mL,得到浓度为2500ng/mL的标准溶液①,将上述标准溶液依次用空白血浆等比稀释,配制成浓度分别为:1250ng/mL,625ng/mL,313ng/mL,156ng/mL,78ng/mL,39ng/mL的ADWX-1标准品溶液,分别标号为②-⑦。测定方法同上,以ADWX-1浓度(C)作为横坐标、沉淀后放射性计数(cpm)为纵坐标进行线性回归,绘制标准曲线。精密度及准确度:精密移取A液适量,用空白大鼠血浆稀释成终浓度为2000ng/mL,313ng/mL,78ng/mL质控溶液,每个浓度各5个样品,同批次测量,测量方法同上,计算日内精密度;同法连续测定3批,计算日间精密度。稳定性考察:精密移取A液适量,用空白大鼠血浆稀释成终浓度为2000ng/mL,313ng/mL,78ng/mL质控溶液,分别考察其在室温放置0,1,2,4,8h;4℃条件下保存0,8,24,48h;-20℃条件下保存0,1,2,4d;反复冻融0,1,2,3次后的稳定性变化情况,测定方法同上。稳定性结果以测定浓度相对于设定浓度或者相对于0h时测定浓度的残余百分数表示,计算公式为:残余百分数(%)=测定浓度/加入浓度或者0h测定浓度×100。1.2.3脏器的注射取清洁级SD大鼠18只随机分成3组,每组6只(雌雄各半),给药前12h禁食、自由饮水,并腹腔注射1%KI溶液0.5mL封闭甲状腺。分别腹部皮下注射给予高(200μg/kg)、中(100μg/kg)、低(50μg/kg)剂量的ADWX-1(其中高、中、低剂量均含22.1生物活性测定不同时段由以上结果可知:3个标记物中,(2)标记物(峰顶段)效果最好,其放射化学纯度为96.77%,比活为645.20GBq/g,故采用(2)标记物进行生物活性测定及后期药代动力学研究。I-ADWX-1的生物学活性测定结果见表2。在相同浓度下,多肽ADWX-1标记前及标记后对HEK293细胞钾离子通道Kv1.3的电流抑制率分别为(73.05±4.53)%和(71.31±6.52)%,标记后的电流抑制率低于标记前,但二者无显著性差异(2.2采用三氯乙酸沉淀法测定了sd大鼠血浆中adwx-1的浓度2.2.1准曲线的回归方程以ADWX-1浓度(C)作为横坐标、沉淀后放射性计数(cpm)作为纵坐标进行线性回归,得到标准曲线的回归方程为:Y(C)=8.163X-60.557,相关系数为0.9999。即ADWX-1浓度在39～2500ng/mL范围内时,沉淀后放射性计数(cpm)与ADWX-1浓度(C)呈线性相关,线性关系良好,最低定量限31.2ng/mL,最低检测限为19.5ng/mL。2.2.2精密度和回收率当大鼠血浆中ADWX-1的终浓度为2000ng/mL、313ng/mL和78ng/mL时,其日间、日内精密度及回收率实验结果见表3。日内相对标准偏差为4.01%～5.24%,日间相对标准偏差为5.45%～10.03%,准确度为90.11%～92.67%,回收率为85.62%～88.31%。2.2.3稳定性3种浓度的ADWX-1在4种条件下的残余百分数为86.61%～107.10%,结果见表4。2.3平均血药浓度-时间曲线及药代动力学参数SD大鼠单次皮下给予200、100、50μg/kg的ADWX-1后的平均血药浓度-时间曲线见图1,主要药代动力学参数见表3。由实验结果可知,大鼠SC给予ADWX-1后的药代动力学过程符合静脉外给药一房室模型一级动力学过程。3同位素示踪法ADWX-1作为一种活性多肽,检测这类蛋白质多肽药物时往往受到诸如生物基质、基质内的蛋白水解、结合蛋白质以及其它许多物质的干扰,直接测定不够准确,且灵敏度低,因此,这类药物的临床前药代动力学研究常使用同位素示踪法。而放射性同位