α和β地贫、苯丙酮尿症、遗传性耳聋

1.α和β地中海贫血病

Mediterraneananemia1.1概述遗传性溶血性贫血血红蛋白的珠蛋白链（α、β、γ、δ链）的一种或几种受到部分或完全抑制地贫分为α、β、δ、δβ等4种类型以α和β地中海贫血较为常见*血红蛋白分子是由四分子的珠蛋白和四分子亚铁血红素组成，珠蛋白约占96%。

*依发病机制和病因分类血红素异常红细胞膜异常珠蛋白异常遗传性红细胞酶缺乏红细胞异常红细胞胞外环境异常免疫性溶血血管性溶血物理、化学、生物因素溶血性贫血失血性贫血造血原料异常造血调节异常造血细胞异常红细胞生成减少性贫血珠蛋白异常合成量异常——地中海贫血机构异常——异常血红蛋白病现状：广泛分布于世界许多地区，东南亚即为高发区之一。我国广东、广西、四川多见，长江以南各省区有散发病例，北方则少见。预防：开展人群普查和遗传咨询、做好婚前指导以避免地贫基因携带者之间联姻；采用基因分析法进行产前诊断，避免重型地贫患者出生。治疗：轻型地贫无需特殊治疗。中间型和重型地贫：一般治疗、输血和铁治疗、铁螯合剂、脾切除、造血干细胞移植、基因活化治疗。1.2病因珠蛋白的肽链——α、β、γ、δ链基因的缺失或点突变造成编码的肽链的合成障碍，导致血红蛋白的组分改变α地中海贫血是由α珠蛋白基因的缺失和基因的点突变所致；β地中海贫血是由β珠蛋白基因的点突变和基因的缺失所致。正常人自父母双方各继承2个α珠蛋白基因（αα/αα）合成足够的α珠蛋白链，各继承1个β珠蛋白基因合成足够的β珠蛋白链。α地中海贫血人类α珠蛋白基因簇位于16pter-p13.3（16号染色体短臂末端到短臂13区3带

）。α地贫大多是由于α珠蛋白基因的缺失所致，少数由基因点突变造成。缺失型α-地贫：占α-地贫的95%以上，由α–基因缺失引起；非缺失型α-地贫：占α-地贫的约5%，由α–基因点突变引起。缺失型α地中海贫血标准型-1或称东南亚型（--SEA）标准型-2静止型HbH病HbBart’s胎儿水肿综合征点突变型α地中海贫血一般只发生于1个α基因上，占α地贫的5%，目前至少发现68种。在中国南方地区主要见两种：HbConstantSpring(CS),HbQuongSze(QS)，点突变型地贫表型较缺失型地贫严重点突变大多位于功能较强的α2基因α2基因发生突变比缺失时α链产量明显减少点突变产生的某些异常血红蛋白可形成不溶物直接损伤红细胞有些非缺失型α-地贫纯合子（αQSα/αQSα、αCSα/αCSα、αQSα/αCSα）可以表现为HbH病；有些非缺失型HbH病（--SEA/αQSα、--SEA/αCSα）的临床表现比缺失型HbH病（--SEA/α3.7α、--SEA/α4.2α）更为严重。β地中海贫血人类β珠蛋白基因簇位于11p15.5。β地中海贫血（简称β地贫）的发生主要是由于基因的点突变，少数因基因缺失。β地贫的发生的分子病理相当复杂，目前在全世界已发现了近200多种突变类型。中国人群中共发现约48余种，其中常见的6种占90%以上。轻型β-地贫：2个基因中有1个基因突变基因型：βN/βT重型β-地贫：2个基因中有2个基因突变基因型：βT/βT1.3诊断方法临床特点、实验室检查，结合阳性家族史，一般可作出诊断。有条件时可作基因诊断。少见类型和各种类型重叠型，进行遗传学和分子生物学检查才能确诊。筛查步骤：MCV(erythrocytemeancorpuscularvolume)、MCH(meancorpuscularhemoglobin)

等Hb分析（HbA2/Hb?）血红蛋白A2增多见于轻型β珠蛋白生成障碍性贫血基因分析临床上的基因检查（如PCR-RDB）只能检测已知突变的类型，有漏诊可能,所以不能单纯只做基因检测。α地贫产前诊断方法1、非侵入性产前诊断：为无创性产前诊断方法，最早于孕12周进行。先用超声检查胎儿是否贫血。心胸比例（孕12-17周≥0.5；孕18-21周≥0.52）、大脑中动脉血流（MCV-PSV＞1.5MOM提示胎儿重度贫血）、胸腔腹腔积液、胎盘厚度、羊水过多等若提示胎儿贫血,再进行侵入性检查；若无提示胎儿贫血，不需要侵入性检查。2、侵入性产前诊断：同β地贫产前诊断方法β地贫产前诊断方法侵入性产前诊断：绒毛穿刺术：10-14周，5-7天出诊断报告羊膜腔穿刺术：16-23周，5-7天出诊断报告脐静脉穿刺术：23周后，5-7天出诊断报告1.4基因分析α-地中海贫血基因检测试剂盒在中国地区普遍发生的α-地贫分别由--SEA、-α3.7和-α4.2位点缺失引起的。PCR方法结合DNA芯片杂交技术根据这三种缺失型的缺失断裂点，设计了三对引物分别检测-α3.7、-α4.2和--SEA，只有当样品发生缺失时，相应的上下游引物距离靠近，扩增出相应条带。将正常内对照（用αα表示）设计在三种共同缺失的位置，以使当发生任一种缺失时正常对照都不扩增。四对引物要在同一管扩增并通过电泳来判断结果，设计引物位置时各PCR产物的条带大小要有区别，最终-α3.7、αα、-α4.2和--SEA的扩增条带分别约为：2.0kbp、1.8kbp、1.6kbp和1.3kbp。α-地中海贫血点突变基因检测试剂盒在中国人群中还存在的α-珠蛋白基因点突变（αT）类型，这是导致临床α地贫漏诊的主要原因之一。作为α地贫3种缺失型检测的补充，对怀疑α地贫有漏诊的患者进行αCS、αQS和αWS突变的诊断，确定具体的基因突变类型。缺失检测结果αT检测结果膜条图片样品基因型αα/αα三个位点N显色，M不显色αα/αααα/-ααα/-ααα/--SEAαα/--SEAαα/αα三个位点N显色，CSM显色αCSα/αααα/αα一个CSM显色,QSN,WSN显色αCSα/αCSααα/--SEAαCSα/--SEAαα/-ααCSα/-α

常见基因检测结果的判定(以CS突变为例)β-地中海贫血基因检测试剂盒PCR体外扩增结合DNA芯片反向点杂交技术，检测人全血样本中β-珠蛋白基因上17个位点的18种突变。β珠蛋白基因有三个外显子，β地贫突变的高频发生区主要在从基因前调控区到第二个内含子之间约1200bp内，针对中国人常见的17个位点，设计两对引物，两扩增片段约为650bp和470bp，这两对引物的扩增片段包含了17个位点的基因信息。针对17个突变位点共设计了17个突变探针。同时设计了7个与突变探针（12个）对应关系的正常对照探针。还有5个少见的突变类型未设计正常对照（只能提供是否突变）。

定性、确定具体基因突变型（41-42M、654M、－28M、71-72M、17M、βEM、31M、IVS1-1M、27/28M、43M、－32M、－29M、－30M、14-15M、CAP、IntM、IVS1-5M）*红色为少见突变类型2.苯丙酮尿症

phenylketonuria,PKU2.1概述一种常见的遗传氨基酸代谢病，常染色体隐性遗传。发病率约为1/10000，临床表现不均一，主要临床特征为智力低下、精神神经症状、湿疹、皮肤抓痕征及色素脱失和鼠气味等，最终成为痴呆。是数千种遗传病中，少数几种可以通过新生儿筛查，早期诊断治疗，并可完全避免智残的疾病。因此,对新生儿早期进行筛查,检测血清(浆)中Phe和Tyr的浓度两个主要实验室指标对诊断PKU具有重要意义。2.2病因苯丙氨酸（phenylalanine,Phe）代谢途径中的酶缺陷，苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，并从尿中大量排出。苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase,PAH)先天性缺陷或突变四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)辅因子的合成和BH4的再循环障碍由PAH缺乏导致者占97%-99%，与四氢生物蝶呤(BH4)合成缺陷有关者占1%-3%，并被称为非经典型PKU。其特征是人体苯丙氨酸代谢异常，导致高苯丙氨酸血症。GTP-CH：GTPcyclohydrolase，三磷酸鸟苷酸环化水解酶6-PTS：PTPS,6-Pyruvoyl-tetrahydropterinsynthase，6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶DHPR：dihydropteridinereductase，二氢生物蝶呤还原酶苯丙氨酸是人体必需的氨基酸之一。正常人每日需要的摄入量约为200-500mg，其中1/3供合成蛋白，2/3则通过肝细胞中苯丙氨酸羟化酶（PAH）的转化为酪氨酸，以合成甲状腺素、肾上腺素和黑色素等。生物蝶呤(B)2.3诊断方法1．新生儿期的诊断：依靠新生儿疾病筛查，阳性儿进行复查，并用定量法（氨基酸分析、高效液相法、荧光法）精确测定。2．新生儿以后的诊断：根据临床诊断和实验室检查。3．实验室检查：尿液检查、荧光免疫法测定血中的Phe和Tyr、苯丙氨酸负荷实验、头颅影像检查：核磁共振（MRI）、尿喋呤分析。苯丙氨酸负荷实验尿蝶呤分析应用高压液相层析（PHLC）测定尿液中新蝶呤和生物蝶呤的含量，用以鉴别各型PKU。典型PKU：尿中蝶呤总排出量增高，新蝶呤与生物蝶呤比值正常。BH4缺乏症：DHPR缺乏：蝶呤总排出量增加，四氢生物蝶呤减少；6-PTS缺乏：新蝶呤排出量增加，其与生物蝶呤的比值增高；GTP-CH缺乏：蝶呤总排出量减少。图正常人、携带者和患者的苯丙氨酸负荷试验的结果Loadtestofphenylananineinnormalman,carrierandpatient新生儿筛查试剂盒：（检测苯丙氨酸）

1.菌环直径：提供苯丙氨酸可使在含抑制剂培养基上的枯草杆菌恢复生长，且生长环的直径与苯丙氨酸的含量呈正比。与标准品比较菌环直径，可得出样品中苯丙氨酸的含量。

2.OD：苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脱氢酶的作用下转化成苯丙酮酸盐，此反应使存在于反应混合物中的辅酶NAD+再生。产生的NADH使加入的黄色Tetrazalium盐发生氧化还原反应生成紫色物质Formazane，OD570nm值与病人样本中的苯丙氨酸浓度成正比。3.荧光：滤纸片上干燥血标本的苯丙氨酸的一种化学方法定量检测。从滤纸片上干燥血标本中洗脱出苯丙氨酸同印三酮形成一种荧光化合物。用荧光读数仪读数。2.4基因分析PAH基因定位于12号染色体的长臂上，即12q22-q24.1。PAH基因除了缺失突变外，大多是点突变。迄今已发现430多种突变(在中国人中也已确定44种突变)，突变大多在外显子区，60%是错义突变。间接诊断：由于尚有30％的PKU患者的基因突变类型还不清楚，因此间接诊断成为对这部分病例进行基因诊断和产前诊断的主要手段。PCR-RFLP、PCR-STR、PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-PASA直接诊断：70%PKU的基因突变已被阐明，直接检测