体内药物分析课件

药学科学分析化学药物分析学药物分析学生物体内药物分析生物体内药物分析前言1药学科学原料药（杂质干扰）复方制剂（多成分之间干扰）制剂（赋形剂等干扰）体内药物（体液干扰、含量降低）中药（极多成分、复杂基质干扰、含量少）中药体内分析（更多成分、更复杂基质干扰、含量少、代谢产物量更少）仪器方法痕量快速灵敏准确精密常量化学方法(动态、活体)

难度递增(静态)2原料药复方制剂体内药物中药体内分析仪器方法(动态、活体)难体内药物分析体内药物分析基本概念生物样品的种类与采集生物样品分析的前处理体内药物分析方法验证体内药物分析应用示例Biopharmaceuticalanalysis3体内药物分析体内药物分析基本概念Biopharmaceuti

体内药物分析（BiopharmaceuticalAnalysis;BiomedicalAnalysis）是随着临床药理学、生物药剂学和生物医学等学科的发展和需要而建立起来的一门药物分析学的分支学科，是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的量变与质变规律的分析方法学。体内药物分析的性质体内药物分析基本概念4体内药物分析的性质体内药物分析基本概念4通过现代分析技术的各种手段，了解药物进入体内后在数量与质量上的变化，获得药物动力学特征、药物相互作用规律、体内生物转化与代谢途径等动态信息；探索涉及药物体内分析的新技术和新方法；为新药研制、药品生产和临床应用等方面的研究提供必要的实验研究手段、作出科学的估计与评价。55体内药物分析

BiopharmaceuticalAnalysis

BiomedicalAnalysis生物药物分析

体液药物分析药物进入体内药物相互作用药物动力学特征体内生物转化及代谢测定生物样本中药物及代谢物样品前处理纯化富集待测组分定量分析现代分析技术LC/MS量变质变6体内药物分析

BiopharmaceuticalAnaly1.研究药物体内过程的重要性2.与新药研究、临床合理用药、药物滥用、兴奋剂检测等密切相关体内药物分析的意义体内药物分析基本概念7体内药物分析的意义体内药物分析基本概念7示例：水杨酸血药浓度与疗效毒性关系药理作用有效血药浓度（g/ml）镇痛50～100抗风湿＞250抗炎350～400中毒＞550致死1600～180088兴奋剂检测Dopingcontrol琼斯承认服用兴奋剂类固醇THG；尿样检查Tetrahydrogestrinone，学名为“四氢乙基羟基二降孕三烯炔酮”。9兴奋剂检测琼斯承认服用兴奋剂类固醇THG；Tetrahydr

1.体内药物分析方法的研究进行生物样品预处理(pretreatment)方法、分离分析实验条件的优化选择，考察体内分析方法的灵敏度、专属性、准确度、线性范围等，为临床药理学、临床药学等相关学科提供专一、灵敏、准确、快速、简便的体内药物分析方法。体内药物分析的任务体内药物分析基本概念10体内药物分析的任务体内药物分析基本概念102.在临床治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）中的应用治疗药物监测即测定血液中或其它体液中药物浓度，观察临床药物反应，考察药物治疗效果，必要时根据药动学原理调整给药方案;方向是实现个体化给药，目的为临床合理用药服务，达到最佳的药物治疗效果。112.在临床治疗药物监测（TherapeuticDrug治疗药物监测治疗范围中毒范围无效范围C最大耐受浓度最小有效浓度治疗药物监测对体内分析方法有特殊要求：即分析方法快速、简便、准确，且血药浓度一般只需测定特定时间的一次数值;常见方法有免疫学、光谱学和色谱学方法。12治疗药物监测治疗范围中毒范围无效范围C最大耐受浓度最小有效浓列为治疗监测药物的一般原则：（1）有效血药浓度范围较窄、剂量小、毒性大的药物。如地高辛、奎尼丁、庆大霉素等。（2）药代动力学个体差异大、药理作用强、且难于通过剂量来控制的药物，如三环类抗抑郁药、苯妥英等。（3）病理状态（如胃肠道疾病影响药物的吸收、肝脏疾病影响药物的代谢、肾脏疾病影响药物的排泄），对某些药物进行血药浓度监测。（4）药物的毒副反应与疾病本身症状相似，如地高辛——房颤毒性反应，监测血药浓度，增减剂量。13列为治疗监测药物的一般原则：133.在药代动力学(Pharmacokinetics)研究中的应用药代动力学研究涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄等动态过程，需要研究血药浓度－时间曲线的变化，探讨药物分布与药理作用的关系;其中生物样品中药物浓度高低差别大，且常需同时测定药物及其代谢产物，因此要求体内分析方法必须具有足够灵敏度和专属性。1414示例：单剂量口服格拉司琼片后人体相对生物利用度研究

本品是一强效、高选择性的外周神经元和中枢神经系统内5-HT3受体拮抗剂。对因化疗、放疗及手术引起的恶心和呕吐具有良好的预防和治疗作用。化疗、放疗及外科手术等因素可引起肠嗜铬细胞释放5-HT，5-HT可激活中枢或迷走神经的5-HT3受体，触发呕吐反射。本品可选择性地阻断这一反射的触发。由于本品的高选择性作用，因而不具有其他止吐药的副作用。15示例：单剂量口服格拉司琼片后人体相对生物利用度研究15色谱条件

色谱柱：LichropspherC18柱，50mm×4.6mm×5µm；

流动相：乙腈-10MM乙酸铵（0.5%乙酸）=40:60

流速：1.0ml/min，进样量20µl质谱条件

ESI离子源，正离子模式检测；毛细管电压：30V

干燥气：氮气380℃；碰撞气：氩气

MRM方式检测：格拉司琼m/z313.4→138；内标m/z270→201

CE电压：16eV（格拉司琼）和10eV（内标）16色谱条件质谱条件16格拉司琼内标待测样品和内标的典型质谱图17格拉司琼内标待测样品和内标的典型质谱图17血样处理

取血浆100µl,置于1.5mlEP管中，加入50µl氢氧化钠碱化，混匀后加入1ml乙酸乙酯涡旋2min液液萃取，于3500rpm离心10min，取上清液0.8ml于40℃水浴下通氮吹干，残留物以50µl

流动相溶解,取上清液20µl进样分析。体内分析方法学评价线性范围：0.0220.00ng.ml-1

最低检测限：0.02ng.ml-1方法回收率：＞97%

基质效应：127%~133%日内日间标准差：＜8.4%。18血样处理18空白血浆标准添加血浆实测血浆19空白血浆标准添加血浆实测血浆19受试制剂和参比制剂药代动力学曲线20受试制剂和参比制剂药代动力学曲线20格拉司琼片相对生物利用度21格拉司琼片相对生物利用度21

4.在生物体内内源性物质测定中的应用体内内源性物质如氨基酸、激素、儿茶酚胺、肌酐、草酸、尿酸等机体正常生理条件或机体发生病变测定体内内源性物质或疾病标志物的含量疾病的辅助诊断或及早预防。兴奋剂检测：睾酮/表睾酮；去氢表雄酮

促红细胞生成素EPO224.在生物体内内源性物质测定中的应用22示例：尿液中多胺的气相色谱-质谱法测定

多胺包括腐胺（putrescine，Put）、精脒（spetrmidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）和尸胺（cadaverine，Cad）。体液中多胺含量的增加，预示着某部分组织生长迅速，或者因恶性肿瘤而促成多胺的增加。因此，测定体液中多胺的含量可以作为临床生化诊断恶性肿瘤的辅助方法。（1）色谱条件HP-5（0.2mm25m）毛细管柱，毛细管初始柱温为110℃，以20℃min-1升温至280℃。气化室温度230℃，接口温度280℃。以氦气为载气，流速0.8mlmin-1，无分流进样，分流阀切换时间0.8min。电离方式：电子轰击（EI），能量70eV，倍增电压2000V。选择离子检测（SIM）：1，3-丙二胺226、254，腐胺（Put）226、267，精脒（Spd）226、254、536，精胺（Spm）226、254，尸胺（Cad）226，内标1，6己二胺226、254。

2323（2）尿样处理收集24小时尿样，加盐酸防腐，记总量，取5ml于-20℃冰箱保存待测。取尿样0.3ml,经酸化水解、碱液中和、树脂纯化，70℃吹干，残留物加乙酸乙酯100μl、七氟丁酸酐25μl，封口后70℃反应30分钟。反应液中和后经正己烷—二氯甲烷（4：1）提取，有机层分离挥干，残留物以50μl乙酸丁酯溶解,取1.0μl进样。2424（3）体内分析方法学评价线性范围：20500ng

线性相关性：r＞0.99回收率：＞75%日内日间标准差：＜8.0%。（4）尿样分析30例正常人尿液中多胺含量统计结果（nmol/24h）─────────────────────────────

1，3丙二醇腐胺尸胺精脒精胺─────────────────────────────

男性（n=15）6.07±4.0539.37±13.959.79±8.81

（21-48岁）女性（n=15）4.45±3.3728.93±8.8511.45±10.86

（18-60岁）─────────────────────────────2525体内药物分析的特点

常规药物分析：原料药物和药物制剂分析真伪鉴别、纯度检查、含量测定共存杂质、制剂辅料、复方药物体内药物分析：复杂生物样品的微量分析药物浓度低样品采量少干扰成分多

体内药物分析基本概念26体内药物分析的特点体内药物分析基本概念26体内药物分析的特点

1、生物样品中药物浓度低，浓度波动范围大，对分析方法灵敏度、线性范围要求高；2、可供分析测定的样品量一般较少，不易重新获得，且具有易变化性，应选择合适方法储存并尽快分离检测；3、生物样品中干扰杂质多，分析测定前一般需经过分离、纯化处理；体内药物分析基本概念27体内药物分析的特点体内药物分析基本概念27

4、选择进行体内分析的方法，在保证一定灵敏度的前提下，要求简便、快速，以便迅速为临床用药及中毒解救提供参考。5、必须配备一定的仪器设备，包括样品冷藏、萃取、浓集等辅助设备以及高灵敏度、高专属性的分析检测仪器。6、生物样品分析工作量相对较大，检测的实验数据处理和阐明有时比较困难，需要相关学科的合作和参与。2828生物样品的种类与采集

体内药物分析研究药物在体内的“命运（fate）”即药物的吸收、分布、代谢和排泄。因此，凡是体内药物到达之处，如体液、器官、组织和排泄物等均是体内药物分析的研究对象。29生物样品的种类与采集29具体考虑体内药物分析的研究对象即生物体内样品，则需要从生物样品来源、样品种类和检测组分三方面来讨论。1.生物样品来源：决定于研究的目的人体与动物2.生物样品种类：如体液、器官、组织和排泄物等3.检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等30具体考虑体内药物分析的研究对象即生物体内样品，则需要从生物样生物样品来源临床前吸收试验组织分布试验代谢排泄毒代动力学临床临床药代动力学制剂生物利用度及生物等效性生物样品的种类与采集31生物样品来源临床前生物样品的种类与采集31生物样品种类选取的一般原则：（1）必须是能够反映出浓度与药物效应之间关系；（2）易于获得；（3）便于处理，适合于分析；（4）根据不同目的与要求进行选取。生物样品的种类与采集32生物样品的种类与采集32均匀生物样品：血液（血浆、血清、全血）、尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液和性腺分泌液等体液、呼出气体非均匀生物样品：心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫或睾丸、脂肪、肌肉、皮肤等器官、组织、粪便排泄物生物样品种类生物样品的种类与采集33生物样品种类生物样品的种类与采集33血液自然凝结加抗凝剂离心离心全血上层：血清（比血浆少纤维蛋白原）（40%）下层：血细胞（凝块）上层：血浆（50%）下层：血细胞示图全血、血浆和血清之间的关系及其制备血样Blood34血液自然凝结加抗凝剂离心离心全血上层：血清（比血浆少纤维下层血浆plasma/血清serum：直接与组织液接触并达到平衡，直接反映作用部位药浓变化，血浆的使用频率高于血清;全血：血浆/血清中的药物浓度+血细胞(贮存库，一般无药理作用）中的药物浓度。35血浆plasma/血清serum：35特点1：尿药浓度通常变化较大；特点2：尿药大多呈结合状态；优点1：易得，且样品量多；优点2：正常尿液仅含微量蛋白；缺点1：尿液是一种良好的细菌培养基；缺点2：尿液中多具有紫外吸收的化合物。尿样Urine36特点1：尿药浓度通常变化较大；尿样Urine36优点1：非伤害性采样，且不受时间地点限制；缺点1：唾液药浓一般低于血浆药浓；缺点2：某些药物的唾液药浓（S）与血浆游离药浓（UP）十分接近，但两者相关系数不明确；缺点3：pH改变会影响弱酸性和弱碱性药物在唾液中的药浓唾液Saliva37优点1：非伤害性采样，且不受时间地点限制；唾液Saliva药物S/P值药物S/UP值卡马西平0.37卡马西平1.1~1.4地高辛0.78地高辛1.2苯妥英0.09~0.11苯妥英1.0~1.4扑米酮0.97~1.08扑米酮0.7~1.0茶碱0.50~0.52茶碱1.1~1.5苯巴比妥0.30-0.38苯巴比妥0.6~1.0氨基比林0.80乙琥胺0.8安替比林0.83~1.0奎尼丁3.6锂盐2.2~2.3利多卡因7.5S：唾液药浓，P：血浆药浓，UP：血浆游离药浓表1一些药物的S/P值与S/UP值38药物S/P值药物S/UP值卡马西平0.37卡马西平1.1~1表2药物随唾液pH变化的类型药物类型实例解离度随唾液pH变化的苯巴比妥、奎尼丁等解离度不随唾液pH变化，但S/UP值不恒定的锂盐、甲氨蝶呤等解离度不随唾液pH变化，且S/UP值相对恒定的苯妥英、卡马西平等39表2药物随唾液pH变化的类型药物类型实例解离度随唾液pH变检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等

（1）原形药物的测定；（2）游离药物的监测；（3）活性代谢产物的监测；（4）药物对映体的监测；（5）作用部位药物浓度的测定；（6）体内内源性物质的测定。生物样品的种类与采集40检测组分：即生物样品中的药物及其代谢物等生物样品的种类与采集种类样品组成采集贮藏优点缺点

血样全血(血…等)+药物及代谢物+结合型采取量限制(<1ml)、时间限制、采血人员限制,根据药物动力学要求确定采样间隔及次数及时分离血浆、血清,抗凝剂,短期4℃,长期-20℃可以测定游离型与结合型，与作用部位处的浓度较一致

采集、前处理最复杂血浆(血…等)+药物及代谢物+结合型血清药物及代谢物+结合型唾液粘蛋白、酶等+游离药物(无时间限制)，刺激少的安静状态采集一般现用采集最不受限制仅反映游离型,变动大,浓度更低尿液尿素、盐类+水溶性药物代谢产物+结合型自然排尿、时间尿防腐剂,短期、长期量最多，反映药物代谢情况不能直接反映血药浓度41种类样品组成采集贮藏优点缺点

全血(血…等)+药物及代谢物+体内药物分析方法学研究

血样尿液唾液胆汁组织器官前处理方法

分离纯化浓集样品测定方法建立方法优化方法学研究灵敏度准确度精密度线性和范围耐用性……灵敏、准确、快速、简便生物样品分析的前处理42体内药物分析方法学研究前处理方法样品测定方法学研究灵敏、准分析过程中的时间消耗分布6%Analysis6%Samplecollection61%Samplepreparation27%Dataprocessing生物样品分析的前处理43分析过程中的时间消耗分布6%Analysis6%Sample生物样品的处理一般原则生物样品贮存生物样品均匀化结合物水解生物基质的性质测定对象的性质44生物样品的处理一般原则生物样品贮存44生物样品的贮存采集哪种生物样品：血浆、血清、全血、尿、组织…血浆酯酶引起的水解——血浆样品—加入酯酶抑制剂微生物导致的腐败——尿液样品—加入防腐剂冷藏储存条件–20℃：大部分药物–80℃：阿莫西林等抗生素加稳定剂：卡托普利等立即测试：维生素C等生物样品分析的前处理45生物样品的贮存生物样品分析的前处理45生物样品均匀化体液样品：

尿液、血浆——涡旋混匀固体样品：

组织、粪便——加入适量溶剂进行高速匀浆生物样品分析的前处理46生物样品均匀化生物样品分析的前处理46结合物水解Ⅱ相代谢产物如葡萄糖醛酸结合物、硫酸酯类结合物极性大、亲水性、不易于提取富集酸水解：简便、快速，不具备专一性，注意药物是否被破坏酶水解：β-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，专一性强，时间长，实验费用高生物样品分析的前处理47结合物水解生物样品分析的前处理47酸水解无机酸，通常用盐酸。使用：酸浓度、酸化时间、是否加热等因药物而异，需实验确定。酶水解常用的水解酶是β-葡萄糖苷酶、硫酸酯酶，或两者混合物。使用：控制pH（4.5-7.0），厌氧温育16小时与酸水解相比：酶水解温和、专属性强，一般不会引起药物分解；但试剂较贵、耗时长、引入黏液蛋白等杂质，可能导致乳化或堵塞生物样品分析的前处理48酸水解生物样品分析的前处理48前处理的目的：

去蛋白，释放药物样品纯化和富集

满足分析方法灵敏度的需要防止分析仪器的污染和劣化满足大量样品分析的需要

微量、快速生物样品分析的前处理49前处理的目的：

去蛋白，释放药物生物样品分析(碱性药物)全血/血浆/组织(1)蛋白沉淀(2)调节pH选择性溶剂提取净化残渣碱回提物酸回提物(酸性药物)衍生物化学衍生化(提取烃基化)RIAHPLCUV/荧光/电化学滤液NPRP原型药物衍生物GCTLC(FID/ECD/NPD/MS)(光密度法检测或洗提后其它法分析)示图样品处理步骤与分析方法的选择生物样品分析的前处理50(碱性药物)全血/血浆/组织(1)蛋白沉淀选择性溶剂提取净化生物样品前处理方法常用的生物样品预处理方法沉淀蛋白液液萃取液固提取……51生物样品前处理方法常用的生物样品预处理方法51生物样品分析的前处理沉淀蛋白操作：

50μl血浆＋150μl甲醇→涡旋1min→3500rpm离心10min→取上清液进样分析常用沉淀剂：与水能混溶的有机溶剂——甲醇、乙腈酸性沉淀剂——三氯醋酸、高氯酸……52生物样品分析的前处理沉淀蛋白52应用中注意问题：去蛋白后的上清直接进样对色谱分离及色谱柱和仪器的影响

色谱峰形液质联用分析中的基质效应检测灵敏度是否足够生物样品分析的前处理53应用中注意问题：生物样品分析的前处理53方法原理常用试剂特点备注有机溶剂蛋白质氢键发生变化而使蛋白质凝聚乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等两法并用时，药物的回收率高超速离心中性盐蛋白质脱水而沉淀饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐超速离心强酸强酸可与蛋白质阳离子形成不溶住盐而沉淀三氯醋酸、高氯酸、硫酸-钨酸混合液、偏磷酸等在酸性下分解的药物不宜超速离心锌盐铜盐金属阳离子与蛋白质的羧基形成不溶性盐而沉淀CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH等

超速离心酶解法组织酶解，药物析出蛋白水解酶中的枯草菌溶素酸不稳定及蛋白结合牢的药物；不适于碱性水解药物无需离心54方法原理常用试剂特点备注有机溶剂蛋白质氢键发生变化而使蛋白质沉淀剂每1容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.0甲醇17.673.498.798.999.2乙腈13.497.299.799.899.810%三氯醋酸99.799.599.899.899.8钨酸盐-硫酸3.399.799.899.9100.0(饱和)硫酸铵21.353.498.3**CuSO4-Na2WO436.597.599.9100.0100.0ZnSO4-NaOH41.194.299.398.899.6常用蛋白沉淀剂的用量及沉淀蛋白的百分率*：样品浑浊，妨碍准确测定55沉淀剂每1容积血浆加入沉淀剂容积0.21.02.03.04.示例血浆样品中虎杖苷前处理方法A：虎杖苷标准对照品由海王集团技术中心天然药物室提供3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷Mr390

B：二苯乙烯苷化学对照品由中国药品生物制品检定所提供2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷Mr40656示例血浆样品中虎杖苷前处理方法A：虎杖苷标准对照品由SD大鼠血浆样品：

乙腈沉淀蛋白；操作简便快速，适用于大量样品；存在色谱柱污染和不可逆堵塞色谱柱：DiamonsilTMC18（5µm，200×4.6mm），Supelco保护柱流动相：甲醇-水（35∶65），流速：1.0ml/min紫外检测波长：290nm(0.0005aufs)柱温：25±1℃JPharmBiomedAnal,41(2006):240-245IF20092.453蛋白沉淀SD大鼠血浆57SD大鼠血浆样品：

乙腈沉淀蛋