《多聚酶链式反应扩增DNA片段》 全市一等奖

多聚酶链式反应扩增DNA片段1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。2．DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3．PCR反应需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。4．PCR原理：DNA热变性的原理。5．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。6．PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。

[自读教材·夯基础]1．细胞内DNA复制的条件原料4种

模板2条DNA母链酶

和

引物使DNA聚合酶能够从引物的

开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸解旋酶DNA聚合酶3′端2．PCR扩增的原理及条件(1)PCR技术：即

，是一种

迅速扩增

的技术。它能以极少量的

为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。(2)扩增方向：总是从子链的

端向

端延伸。多聚酶链式反应体外DNA片段DNA5′3′(3)引物：①特点：是一小段

或

，能与

的一段碱基序列互补配对，用于PCR的引物长度通常为

个核苷酸。②需要引物的原因：DNA聚合酶不能

，而只能从

延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。DNARNADNA母链20～30从头合成DNA3′端DNA的热变性DNA两条模板链脱氧核苷酸耐高温的缓冲溶液自动调控温度3．PCR的反应过程(1)

：温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链

(2)

：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

(3)

：温度上升到72℃左右时，在

酶的作用下，四种脱氧核苷酸通过碱基互补配对合成新DNA链变性复性延伸DNA聚合1．DNA复制时为什么需要引物？提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？提示：不需要。3．利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？提示：1/2n；100%。

[跟随名师·解疑难]1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较细胞内DNA复制PCR不同点解旋解旋酶，边解旋边复制80℃～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温子链合成一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连结(滞后链)两条子链均连续合成相同点①提供DNA模板②四种脱氧核苷酸作原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端2．PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图：(2)复性：系统温度下降至50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：(3)延伸：当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：[特别提醒]PCR反应的结果①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。 [自读教材·夯基础]微量移液器1．实验操作程序准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上移液：用

按照配方在微量离心管中依次加入各组分混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

：将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是

使反应液集中在

反应：将离心管放入

中，设置程序进行反应离心管底部PCR仪2．DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在

的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数。260nm离心 [跟随名师·解疑难]1．实验操作注意事项(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。2．结果分析与评价DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测量，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下：(1)稀释：取2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。(3)测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为：DNA含量(μg/mL)＝50×(260nm的读数)×稀释倍数。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。[特别提醒]

公式中的50代表在波长260nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50μg/mL。[例1]多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下变性(使模板DNA解旋)→55℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中不正确的是(

)A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的C．延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高[解析]变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。[答案]

C(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。[例2]在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：a链5′－G－G……T－C－3′

5′－G－G－OH(引物Ⅰ)

b链3′－C－C……A－G－5′(引物Ⅱ)

95℃5′－G－G……T－C－3′

3′－C－C……A－G－5′

55℃5′－G－G……T－C－3′

3′－C－C……A－G－5′

72℃5′－G－G－OH

________________

________________(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是________；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________。[解析]

(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，引物就提供了3′端。子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′－G－A－OH，复性结果为：

HO－A－G－5′5′－G－G……T－C－3′。(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。[答案]

(1)5′－G－A－OH

a链5′－G－G……T－C－3′

HO－A－G－5′(2)5′