河南科技大学微生物工程学课件第二章菌种2、3节

第二节菌种来源Chapter1continued一、分离与筛选的设计要求1.在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：1、菌的营养特征一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料2、菌的生长温度(较高温)3、菌的稳定性(连续几代)4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性6、容易从培养液中回收产物3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株1.菌种分离的一般过程(引入选择压力)样品的采取→

预处理→

富集培养→

菌落的选择→产品的鉴定目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物二、菌种分离与筛选工作程序2.培养分离中要解决的问题“分离什么和从哪里分离出?”必须充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度、生物群体培养和产品生产工艺及其提纯的难易和费用，工业生产发酵罐中稳定性及遗传操作的难易程度等。选择适宜的培养分离方法和检测方法。三、含微生物样品的采集较复杂；应根据分离目的灵活掌握土壤（丰富、5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）食品、海水、动物、植物、极端环境根据微生物的营养类型采样森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样杨尺蠖赤松毛虫侧柏毛虫四、含微生物样品的富集培养富集(enrichment)培养

是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需的菌株。其要领是提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件，例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。控制氧可将好氧微生物和厌氧微生物分开；高温下培养可将嗜热微生物和非嗜热微生物分开；控制pH可分离嗜酸或嗜碱微生物；高糖或高盐培养基可分离耐高渗透压微生物；在分离培养中加入抗生素或某试剂可增加选择性

如分离真菌可在土豆培养基中加入链霉素；分离细菌或放线菌可在培养基中加入制霉菌素等重复移植几次后接种少量已富集的培养物到固体培养基上。移植时间是关键，应在所需菌种确已占优势的情况下进行。五、利用固体平板的生化反应进行分离（方法之一）

利用特殊的分离培养对大量混杂微生物进行初步分离的方法。

分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。

可显著提高分离效率透明圈法变色圈法生长圈法抑菌圈法1、透明圈法

分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊；

能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质－酪蛋白）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌

分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛

在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈2、变色圈法

对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。如筛选果胶酶产生菌甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈又如分离解脂微生物豆油作底物中性红（红～黄.6.8～8.0.）指示菌落周围呈红色圈3、生长圈法

通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈

工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌4、抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的分离筛选据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法

工具菌采用抗生素的敏感菌若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。

但作为初筛的手段是有意义的第三节菌种选育菌种选育

应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。

菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。自然选育诱变育种杂交育种(有性、准性)原生质体融合育种基因工程育种一、自然选育

在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。

自发突变(spontaneousmutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。

一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。

多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实际上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质（基站、地板砖）自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过氧化氢等）自然突变两种情况：生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下降对生产有益的：生产性能提高制备单孢子（单细胞）悬液适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株自然选育的一般程序：

自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。（逆水行舟，不进则退）自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。二、诱变育种

诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。

目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。一）诱变育种的一般步骤原始菌株（出发菌株）细胞或孢子悬液制备活细胞计数诱变剂处理活细胞计数中间培养突变株分离初筛复筛生产性能试验诱变预备处理诱变育种的工作程序1、出发菌株的选择选择时注意以下几点：1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。2）最好选用已经过选育的自发突变菌株。3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。2、单细胞（或单孢子）悬液制备一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。因为

1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂

2）可避免长出不纯的菌落。霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。3、诱变剂及使用剂量的选择凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。如紫外线、X-射线、Co60、-射线、快中子、超声波，等离子等硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍

(NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等诱变剂物理诱变剂化学诱变剂紫外线(Uv)

使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广

对诱变最有效的波长是260nm左右(253-265nm)

作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡.快中子

中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2-10百万电子伏特，慢中子能量为1/4至100电子伏特。慢中子的效应同射线、射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。氮芥

氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。

应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。亚硝酸

常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。

亚硝酸A——H（次黄嘌呤）C——UG——X（黄嘌呤）

亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出NO和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。亚硝基胍(NTG)

是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%至80%的营养缺陷型菌株，有超级诱变剂之称。在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。通常在浓度为30ug/ml、温度为28ºC和时间为60min的条件下进行处理，容易得到高产菌株。剂量确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。

凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。处理方法单一诱变剂处理复合处理1）两种或多种诱变剂先后使用2）同一诱变剂重复处理3）两种或多种诱变剂同时使用菌种单独处理诱变剂突变率（%）复合处理诱变剂突变率（%）土曲霉紫外线X-射线21.319.7紫外线+X-射线42.8土曲霉氮芥（0.1%）紫外线不明显4.7氮芥+紫外线11.0链霉菌紫外线-射线31.035.0紫外线+-射线43.6金色链霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5二乙烯三胺+紫外线硫酸二乙酯+紫外线26.635.9诱变剂的复合处理及其协同效应4、诱变处理后的后培养表型迟延现象

生理性分离性遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。因此必须在完全培养基中