应用基因工程课件

应用基因工程什么是基因工程分子水平提取/合成生物的遗传物质：DNA(基因）/RNA——生物供体体外切割→与载体拼接——DNA重组重组DNA引入受体细胞或生物体，使这种外源DNA（基因）复制与表达又称遗传工程、DNA重组技术、分子克隆、基因克隆什么是基因工程药物基因工程制备具有疾病治疗或预防价值重组蛋白质/多肽DNA或RNA根据人类的需要繁殖基因、或表达其产物、或创造新性状并稳定遗传给下代人类细胞细胞核一、基因的获取染色体被切成小片段，鉴定“目的基因”染色体片段目的基因含有目的基因的片段聚合酶链式反应（PCR）1985年Mullis发明PCR（polymerasechainreaction）快速扩增DNA的方法模仿体内DNA的复制过程——首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增靶序列变性和引物复性循环1循环2循环3变性和引物复性链延伸Taq酶链延伸PCR原理示意图二、切割DNA的酶

——限制性内切酶限制性内切酶（II型）特异识别和切割4-8个bp长度且具有回文序列的DNA片段数百种产生粘性末端三、连接DNA的酶

——DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，完成基因重组的过程——“重组质粒”“载体”：基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具表达载体与克隆载体细菌、酵母、植物细胞、动物细胞四、导入/表达重组DNA（重组质粒）导入受体细胞（生物体），目的基因得以复制和表达细菌酵母植物细胞动物细胞基因枪绿色荧光蛋白（GFP）基因工程在工业领域的应用环保工业——残留农药降解、降解石油酶制剂工业食品工业化学与能源工业基因工程在农业领域的应用农作物新品种——抗寒、抗旱、抗盐碱、抗病除草剂转基因动物、转基因植物基因工程在医药领域的应用基因工程药物——转基因植物、转基因动物基因诊断和基因治疗转基因植物传统的杂交技术基因工程技术一、农作物基因工程（一）抗虫转基因作物（二）抗病毒作物（三）抗细菌和真菌作物（四）抗除草剂转基因作物（一）抗虫转基因作物苏云金杆菌（BT）毒素蛋白：苏云金杆菌（Bt）产生的毒素蛋白有高度特异杀鳞翅目昆虫的活性毒素蛋白被摄食进入昆虫中肠，在昆虫的中肠消化酶的作用下，原毒素降解成有毒性的多肽，结合到中肠上皮细胞表面的特异受体上，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞的肿胀裂解，最后导致细胞死亡苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因

抗病基因＋抗虫基因＋优质基因

（二）抗病毒作物植物病毒感染后，被感染的植株常出现矮化、枯死；被感染的叶子常出现花叶（斑点叶、黄叶）、卷叶或畸形经济作物减产或绝收烟草花叶病毒水稻病毒病花生病毒病：影响我国花生产量的重要病害。一般年份，病毒病引起减产5%-10%，大流行年份能减产20%-30%小麦丛矮病：平均造成30%的产量损失油菜病毒病：造成的产量损失常年达20-30%

自1986年Powel-Abel首次将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白（CP）基因导入烟草，培育出抗TMV植株以来，已经针对许多病毒成功的构建了多种抗病毒植株，如抗番茄花叶病毒（TOMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、苜蓿花叶病毒（ALMV）、黄瓜花叶病毒（CNV）、水稻条纹病毒（RSV）等抗性植株。（三）抗细菌和真菌作物将“抗菌肽”基因导入植物将“溶菌酶”基因导入植物（四）抗除草剂转基因作物

除草剂的作用机制是破坏氨基酸的合成途径和破坏植物光合电子传递链蛋白质的功能。通过改变除草剂靶酶的水平、修改靶酶的敏感性和解除除草剂毒性酶基因，将解除除草剂的编码蛋白基因导入宿主植物，使宿主植物免受伤害。（五）抗非生物胁迫作物1.抗旱2.抗寒3.抗盐4.抗氧化5.抗早熟(六）其他转基因农作物黃金米(GoldenRice)：一种转基因大米品种,含有可合成β胡萝卜素的基因,可合成維生素A的前体物，可缓解发展中国家维生素A缺乏的问题。莎弗西红柿（转基因延熟番茄）：将“延熟基因”转入西红柿，延长西红柿的的成熟期。二、生物反应器

转基因植物作为一种新型的生物反应器，可以生产过去只能从稀有植物乃至其它生物体才能获得的，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质。如激素、抗体、疫苗、营养蛋白、酶、生长因子、药物及保健品等。三、转基因植物的安全性

随着转基因技术的飞速发展以及转基因生物的大面积推广，在关注转基因生物所带来的巨大社会、经济和生态效益的同时，转基因生物及其产品的安全性问题也引起世界范围内的广泛关注。农业转基因生物及其产品对人类健康和生态环境是否会带来潜在不良影响，已引起人们的普遍关注。在人类的科技发展史上，除了40年代中期发展起来的核技术外，恐怕没有像基因工程技术一样，在全世界引起如此大的关注和争议了。

（一）标记基因的安全性（二）转基因植物的安全评价和争论的问题1.环境安全（1）生存竞争（2）生殖隔离距离（3）与近缘野生种的可交配性（4）对非靶生物的影响（5）病毒发生变异重组或异源包装的可能性2.转基因植物食品安全性及对人健康的影响转基因动物利用基因工程技术将目的基因导入动物受精卵或早期胚胎内，使目的基因随细胞分裂而增殖并在体内表达，且稳定地遗传给后代的动物加速动物育种建立人类疾病模型提供人体移植器官研究基因表达调控转基因动物作为生物反应器一、动物转基因技术关键技术目的基因的获取DNA重组——目的基因与“载体”的连接重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞胚胎移植技术转基因动物的鉴定（一）显微注射法（microinjection)显微注射法的流程（二）逆转录病毒法逆转录病毒的生活周期逆转录病毒法的流程卵裂和胚泡的形成（三）胚胎干细胞法胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES细胞）——全能性ES细胞在解除分化抑制的条件下，具有（生殖腺等）各种组织的发育潜力，即ES细胞具有发育成完整动物体的能力

胚胎干细胞法的流程（四）精子载体法精子载体法的流程（五）体细胞核移植法Dolly二、转基因动物的应用动物育种中的应用提高动物的抗病能力提高动物生长速度提高动物产毛性能改善乳品品质在基因功能等生命科学基础研究中的应用基因敲除技术（knock-out)医药科学研究中的应用药理学中的应用人类疾病模型动物生物反应器（从转基因动物体液或血液中收获基因产物）原理：将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内以制备转基因动物，并使外源基因在动物体内（乳汁、血液等）高效表达，然后再分离提取目的基因编码产物乳腺生物反应器（mammarybioreactor)

动物药厂通过转基因动物生产感兴趣的基因

↓把YFG放在β—乳球蛋白的启动子下

↓注入羊卵细胞→植入借腹怀孕的母羊体内

↓YFG在乳腺中表达

↓乳汁中提纯YFG蛋白。

产品名称治疗功能与医药范围

人胰岛素治疗糖尿病人生长激素治疗侏儒症，加速创口愈合

α干扰素治疗癌症、病毒感染

β干扰素治疗带状疱疹，眼结、角膜炎

γ干扰素治疗癌症、病毒感染

人组织纤溶酶原激活因子(tPA)溶解血栓，治疗急性心肌梗塞红细胞生成素(Epo)治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平超氧化物歧化酶清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死

凝血因子Ⅷ治疗A型血友病

神经生长因子维持神经元细胞存活、生长和分化蛋白质和多肽类活性物质基因治疗疾病基因的发现1990年美国科学家首先启动人类基因组计划（HGP），计划历时15年，至2005年完成2001年2月12日由《科学》和《自然》杂志同时向世界宣布，人类基因组3X109bp的最新图谱，约含34万个基因揭示人类4万个基因功能的任务非常艰巨已知人类遗传性疾病约有3000种一、基因治疗的概念改变人遗传物质为基础的生物医学治疗通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法疾病的根源——异常的基因

基因治疗概念的扩展——凡是采用分子生物学技术和原理，在核酸水平上展开的对疾病的治疗二、基因治疗的策略基因置换：用正确的基因原位置换错误的基因——最理想的策略基因修复基因修饰（基因增补）：不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，弥补基因的功能——最主要的策略基因失活免疫调节三、基因治疗中治疗基因导入病人体内的方式直接体内疗法:治疗基因→→体内靶细胞间接体内疗法:从体内取出靶细胞→→导入治疗基因→→筛选\扩增→→回输体内治疗基因的导入方式四、基因治疗的基本程序治疗性基因的选择基因载体的选择：病毒载体，非病毒载体靶细胞的选择：体细胞（干细胞），生殖细胞（X）基因转移：间接体内疗法，直接体内疗法外源基因表达的筛选（一）治疗性基因的选择单基因（疾病）多基因（疾病）：心血管疾病、代谢性疾病恶性肿瘤：原癌基因，抑癌基因病毒性疾病基因治疗的范围（二）基因载体的选择病毒载体系统(>70%)定向感染性、寄生性剔除致病基因和复制相关基因逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒非病毒载体系统(<30%)效率低，安全性高<腺病毒作为载体导入治疗基因（三）靶细胞的选择体细胞:造血干细胞、皮肤成纤维细胞、肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞生殖细