超敏反应性疾病的免疫检测（免疫学检验课件）

第二十四章

超敏反应性疾病免疫学检验本章要点激发试验的概念、类型与临床应用。1血清IgE的检测方法、临床意义与应用评价。2药物过敏筛选实验技术类型及应用。3循环免疫复合物检测技术。4前言超敏反应（hypersensitivity）：机体再次接受相同抗原刺激后，发生的以组织细胞损伤或生理功能紊乱为主的病理性免疫应答。变应原（allergen）：引起超敏反应的抗原。超敏反应性疾病检测：主要通过体内激发试验和体外核心组分检测，明确变应原和可能机制，辅助诊疗。CONTENTS目录01020304激发试验血清lgE检测免疫复合物检测技术药物过敏筛选实验激发试验01激发试验01基本概念02皮肤激发试验03支气管激发试验04支气管激发试验05其他激发试验激发试验一、基本概念激发试验（provocationtest）模拟自然发病条件，用少量变应原引起一次较轻的超敏反应发作，达到确定或排除变应原的一种体内试验。非特异性激发：用组胺等刺激物做雾化吸入，观察患者敏感性，分析病因或评估疗效。特异性激发：用特异性抗原作刺激物，观察是否诱发相应反应，有助于明确变应原。激发试验二、皮肤激发试验（一）试验类型及方法皮内试验（intradermaltest）点刺试验（pricktest）斑贴试验（patchtest）激发试验（二）结果判断与分级标准速发型皮肤试验结果判定：阳性反应以风团为主；点刺试验的阳性反应以红晕为主。迟发型皮肤试验结果判定：阳性结果以红肿和硬结为主。激发试验分级皮内试验点刺试验—无风团反应或小于阴性对照无风团反应或小于阴性对照+风团3mm～5mm、红晕＜20mm无风团，阴性对照＜红晕≤20mm++风团6mm～9mm、伴红晕无风团，红晕＞20mm+++风团10mm～15mm、伴红晕风团伴红晕++++风团＞15mm伴红晕且有伪足风团伴红晕且有伪足

速发型皮肤试验的结果判断标准激发试验迟发型皮试和斑贴试验结果判定标准反应程度迟发型皮试斑贴试验—无反应或小于阴性对照无反应或小于阴性对照+仅有红肿轻度红肿、瘙痒++红肿伴硬结明显红肿、时有红斑+++红肿、硬结、小疱红肿伴皮疹、水疱++++大疱或（和）溃疡红肿、水疱伴溃疡激发试验（三）结果分析与注意事项假阴性出现的常见原因：试验抗原的浓度过低或者抗原失效；患者皮肤反应差，或者试验前服用免疫抑制剂或抗组胺药物；操作误差；时间选择不当。1234激发试验（三）结果分析与注意事项假阳性出现的常见原因：试验抗原不纯；试验溶液非特异性刺激；皮肤反应性过强；手法过重或操作不当。1234激发试验（四）应用与评价寻找变应原预防药物过敏评估机体细胞免疫功能预防皮肤接触过敏1234激发试验三、支气管激发试验(bronchialprovocativetest,BPT)测定支气管吸入某种刺激性物质后产生收缩反应程度的方法，亦称气道反应性测定；吸入一定量的激发物；比较吸入前后肺通气功能指标；判断气道高反应性程度。激发试验（一）试验类型及方法特异性BPT将一定浓度的抗原刺激物装入雾化器中使受试者口或鼻吸入雾化颗粒，其携带激发物在支气管树及肺泡沉积而起作用；非特异性BPT将一定浓度的激发物装入雾化器中，进行同特异性BPT的操作；吸气流速、雾化颗粒直径的大小及气道通畅与否均可影响雾化颗粒在气道的沉积，从而影响气道的反应性。激发试验（二）测定指标及结果判断支气管反应有三种类型：速发、迟发和双重反应。每次观察不能小于24小时。测定指标：FEV1：重复性好，结果稳定；PEF：峰流速仪价格低廉、方便、不受场地限制，与FEV1有较好的相关性，适合流行病学调查；sGaw：敏感性好，但重复性稍差。激发试验（二）测定指标及结果判断定性判断：变应性的确定常以定性实验判断结果；1、阳性：气道反应性增高。FEV1、PEF较基础下降≥20%或sGaw下降≥35%，有时伴有明显自觉症状或肺部闻及哮鸣音。2、阴性：气道反应性正常。FEV1、PEF或sGsw＜以上标准，正常值为阴性。无论激发试验阳性或阴性，均应排除气道反应性的影响因素。可疑者，间隔2～3周后复检或2个月后再测。激发试验（三）注意事项及禁忌症禁忌证：有心或肺功能不全、高血压、甲亢、妊娠等；严重咽喉炎，呼吸道感染或肺炎者；一周内有呼吸道感染、预防接种、职业性过敏因素的接触等；有过敏性休克、严重的血管性水肿及严重的喉头水肿病史者；呼吸功能严重受损，基础PEF或FEV1值少于预计值70%者；身体极度虚弱,不能耐受本试验者。激发试验（三）注意事项及禁忌症注意事项:详询病史，排除禁忌症，避免药物干扰；基础FEV1占预计值70%以上才能进行试验；受试者应为哮喘患者病情稳定时或缓解期；吸入激发物的浓度应从小到大，逐渐递增；应备有急救器械、药品和有经验的临床医生在场。激发试验（四）应用与评价特异性高；与受试者病史、症状、体征相关性较强；主要用于确定支气管哮喘变应原；可检测新制剂的抗原性、评价平喘药疗效和脱敏治疗效果。试验不足在于存在一定风险；每次仅能检测一种抗原；需要专门的设备和技术。激发试验四、食物激发试验排除性饮食1周后，食物激发试验在医院内进行；排除的可疑食物以普通形式从不引起症状的小量开始，观察一段时间(结合病史确定观察时间)；若无症状，则将食物逐渐加至常量，院内观察2小时，监测呼吸、心率及皮肤改变；无症状者回家继续该试验，电话随访2～4天，若出现反应则来医院证实。激发试验五、其他激发试验口腔激发试验主要用于食物、药物等变应原检查；结膜激发试验主要用于眼部超敏反应性疾病的变应原检查；鼻黏膜激发试验主要用于花粉症和变应性鼻炎的变应原检查。123血清lgE检测02血清lgE检测血清tlgE检测血清slgE检测针对特定变应原的特异性IgE（specificIgE，sIgE）。血清lgE检测一、血清tlgE检测（一）检测方法酶联免疫测定法：酶标显色，敏感性高，操作方便；化学发光法：用化学发光物质标记抗IgE，更敏感、特异、自动化程度高，临床普遍使用。12血清lgE检测（二）临床意义血清tIgE水平一般用国际单位（IU）或ng表示；正常人群血清tIgE水平存在一定差异；一般认为大于333IU/ml（800ng/ml）时为异常升高；过敏患者tIgE水平可高于正常人数千倍；药物间质性肺炎、支气管肺曲菌病和某些寄生虫感染时tIgE也会升高；需注意有些过敏患者血清tIgE水平不高，而tIgE水平高的并非都是过敏患者。血清lgE检测二、血清slgE检测（一）检测方法RAST公认最有效的检测手段之一，特异性强、敏感性高、影响因素少；但存在放射性危害，操作复杂。ELISA常用间接法，酶标记抗IgE，操作敏感性、特异性较高，操作简便、且费用较低。IBT将多种特异性变应原提取物包被于硝酸纤维素膜上，酶标记抗IgE，操作简单，可一次性测定多种变应原。123血清lgE检测ELISA间接法检测特异性IgE（+）YYYYYYYEYEYEYYYYEYEYE洗涤洗涤洗涤结果1.已知变应原包被载体2.待检特异性IgE抗体3.酶标动物抗人IgE4.底物显色血清lgE检测IBT检测特异性IgE特异性变应原加入待检血清转印至NC膜NC膜待检血清特异性IgE抗-IgE·HRP底物特异性抗原条带显色NC膜—变应原—特异性IgE—抗-IgE·HRP血清lgE检测（二）临床意义sIgE测定是体外检测变应原的重要手段，主要用于Ⅰ型超敏反应的诊断；根据sIgE含量可确定患者变应原种类，评价患者过敏状态、脱敏治疗的疗效，对过敏性疾病的诊断和鉴别诊断有重要帮助。免疫复合物检测03免疫复合物检测01基本概念02抗原非特异性CIC检测技术03CIC检测方法评价及应用04沉积于组织中IC的测定免疫复合物检测免疫复合物（immunecomplex,IC）：指由抗原与相应的抗体结合而成的复合物。局部免疫复合物：沉积在机体的某一局部。循环IC（circulatingIC,CIC）：血液中存在的IC。一、基本概念免疫复合物检测抗原特异性IC抗原非特异性IC不考虑形成IC抗原的性质，检测未知抗原与相应抗体形成的IC总量。检测已知抗原与相应抗体形成的IC。免疫复合物检测CIC：分子量600kD以上，沉降系数＞19S。热聚合IgG（HAHG)：作为参考标准品，绘制标准曲线进行CIC定量或测定A值代表CIC相当于HAHG的含量。二、抗原非特异性CIC检测技术免疫复合物检测CIC的检测方法：按抗体分子在结合抗原后发生的物理学和生物学特性的改变而设计，主要方法：PEG比浊法；ELISA法；Raji细胞法；抗球蛋白技术—mRF凝胶扩散试验。二、抗原非特异性CIC检测技术免疫复合物检测以ELISA法为例基本原理ELISA法测定的CIC，是能够结合C1q的IgG类抗体与其特异性抗原形成的CIC；技术要点将聚苯乙烯包被上C1q，加入受检血清，CIC中IgG的Fc段与C1q结合，再加抗人IgG·HRP，形成C1q-CIC-抗人IgG·HRP复合物，加底物显色。12免疫复合物检测以ELISA法为例方法评价：灵敏度高于PEG比浊法，可检测到0.1µg/mL；重复性好，相对稳定；C1q制品不易精制,纯品不稳定，只能检出与补体结合的CIC。3免疫复合物检测三、CIC检测方法评价及应用（一）检测方法评价方法学待改进；IC机理研究待深化12免疫复合物检测（二）临床应用对于明确的免疫复合物病，如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、部分肾小球肾炎和血管炎等。辅助诊断；评估疗效和疾病进展。12免疫复合物检测四、沉积于组织中IC的测定常用免疫組化技术：如荧光免疫组化技术检测标本组织中的Ig和补体，荧显微镜下观察荧光染色的IC沉积物的分布和性质，了解受累组织的成分、构型和特定部位评估疾病的严重程度和治疗方案。药物过敏筛选实验04药物过敏筛选实验01实验策略02嗜碱性粒细胞组胺释放试验03人嗜碱性粒细胞脱颗粒试验药物过敏筛选实验药物超敏反应研究切入点以组胺为代表的介质释放检测。常以嗜碱性粒细胞为观察模型。变应原刺激剂致嗜碱粒细胞释放组胺，可以检测出嗜碱性粒细胞的释放能力，变应原刺激剂可以特异性确定变应原的类型。一、组胺含量测定药物过敏筛选实验BHRT是变应原刺激剂刺激纯化、洗涤后的嗜碱性粒细胞悬液而后释放化学介质组胺，通过测定组胺的量来反映嗜碱性粒细胞的释放能力。BHRT的结果可以从细胞释放一定量的组胺所需要的变应原浓度或在一定浓度的变应原作用下细胞所释放定量的组胺量来表达。实验的灵敏度高，结果可靠，但价格较高。二、嗜碱性粒细胞组胺释放(basophilhistaminereleasetest，BHRT)药物过敏筛选实验嗜碱性粒细胞内大量的嗜碱性颗粒，可被碱性染料阿新利蓝染成蓝色，易于辨认和计数。当加入过敏原或抗IgE抗体后，与结合在嗜碱性细胞表面的IgE结合，受体交联，细胞质内颗粒脱出，细胞不再着色。从染色细