分子生物学7-课件

RNA的转录合成-

真核生物的RNA转录专业：生物技术院系：生命科学学院2023/7/27MultipleformsofeukaryoticRNApol.MorepromotersEnhancers,silencersetccis-elementsandtrans-fators

真核基因转录的特点单顺反子聚合酶高度分工Trans-factorsCis-elements真核基因的转录以正调控为主。真核生物的RNA聚合酶三种不同的RNA聚合酶根据它们对α-鹅膏蕈碱（α-amanitin）的敏感性不同分为RNA聚合酶I、II、III。

对抑制物的敏感性

酶的种类

对高浓度α-鹅膏蕈碱敏感

RNA聚合酶III

对低浓度α-鹅膏蕈碱敏感

RNA聚合酶II对α-鹅膏蕈碱不敏感

RNA聚合酶I

定位及产物PolymeraseIImakesHeterogeneousnuclearRNA(hnRNA)RNApolymeraseinEukaryotes

RNApol.I,II,IIIL’with78%±homologousbetween3RNApol.I,II,IIIL’~β’ofprokaryoteRNApol.β(功能相似)IncludingL,L’subunit&7-12smallsubunitsRNApolII(B);---Forpre-mRNAtranscription---Locatedinnucleoplasm---L’maximumsubunit240kd&havespecificCOOH-endnamedCTD(CarboxylTerminalDomain)onlyinRNApolII---CTD-end;7aarepeats&highfrequencyphosphorylationTyr—SerP—Pro—ThrP—SerP—Pro—SerP

Yeast26XDrosophila44Xrepeatunitof7aa/inCTDRat&Human52X

CTD中的Ser和Thr可被高度磷酸化，并且可逆。磷酸化的RNApolⅡ被称为ⅡA非磷酸化的RNApolⅡ称为ⅡBCTD参与转录→ⅡB→ⅡA→使RNApol易于离开启动子进入延伸过程（10倍）去磷酸化的RNAIIpol（B）在转录起始时结合于启动子，磷酸化的RNAIIpol(A)在延伸过程中有作用。定义：RNA聚合酶和基本转录因子（bTF）的结合区域，它们共同组装成转录起始复合物。PromotersThreeeukaryoticRNApolymeraseshave:DifferentstructuresTranscribedifferentclassesofgenesExpectthatthe3polymeraseswouldrecognizedifferentpromotersClassIIPromotersPromotersrecognizedbyRNApolymeraseII(classIIpromoters)aresimilartoprokaryoticpromotershavetwoparts:Corepromoterhaving4elementsUpstreampromoterelementUPECorePromoterElements–TATABoxTATAboxFoundonthenontemplatestrandVerysimilartotheprokaryotic-10boxTherearefrequentlyTATA-lesspromotersHousekeepinggenesthatareconstitutivelyactiveinnearlyallcellsastheycontrolcommonbiochemicalpathwaysDevelopmentallyregulatedgenesCorePromoterElementsInadditiontoTATAbox,corepromotersare:TFIIB

recognitionelement(BRE)Initiator(Inr)Downstreampromoterelement(DPE)AtleastoneofthefourcoreelementsismissinginmostpromotersTATA-lesspromoterstendtohaveDPEsandhaveGCboxtocompensateforthelackofTATAboxPromotersforhighlyspecialized(luxury)genestendtohaveTATAboxes

PromotersforhousekeepinggenestendtolackthemTATA区主要作用是使转录精确起始，如果该区缺失或发生突变则导致转录起始位点不确定。在二类启动子里，TATAbox是转录起始复合体蛋白组装的位置。第一个结合在该位点的蛋白是TBP，当其结合后，会增加其他转录因子结合的几率。UpstreamElementsUpstreampromoterelementsareusuallyfoundupstreamofclassIIcorepromotersGCboxesbindtranscriptionfactorSp1-110~-80CCAATboxesbindCTF(CCAAT-bindingtranscriptionfactor)-80~-70Upstreampromoterelementscanbeorientation-independent,yetarerelativelyposition-dependentATATAACCAATGCCACACCC

或GGGCGGG+1转录起点TATAboxCAATboxGCbox增强子-35~-25-80~-70-110~-80promotermodel(RNAPolII)GCbox可能有多个，如果发生突变或者缺失，则会对活性有很大影响，比如SV40earlygene具有6个GCbox，丢失1个活性只有33%，丢2个则有13%，3个则无活性GCbox具有位置依赖性，但没有方向依赖性。如果离开TATAbox太远则不起作用。CCAAT区和GC区主要控制转录起始频率，基本不参与起始位点的确定。CAAT区域任何碱基改变对转率起始频率和强度影响都很大。另外在TATA区和UPE区域插入核苷酸序列也会降低活性。这2个区域方向对于转录的影响不大。ClassIPromotersClassIpromotersarenotwellconservedinsequenceacrossspeciesGeneralarchitectureofthepromoteriswellconserved–twoelements:CoreelementsurroundingtranscriptionstartsiteUpstreamcontrolelement(UCE)100bpfartherupstreamSpacingbetweentheseelementsisimportantRNApolⅠpromoter+1+6-31-100UCE:50~80bpCorepromoterPre-rRNAgeneEnhancetranscriptionEssentialfortranscriptionClassIIIPromotersRNApolymeraseIIItranscribesalotofshortgenesThesehavepromotersthatliewhollywithinthegenesThereare3typesofthesepromotersPromotersofSomePolymeraseIIIGenesTypeI(5SrRNA)has3regions:BoxAShortintermediateelementBoxCTypeII(tRNA)has2regions:BoxABoxBTypeIII(nonclassical)U6snRNA基因基本转录因子bTF组成型转录因子广泛的DNA结合蛋白一般是针对polII催化转录必需TFRNA聚合酶II的转录因子：作用于TATA框的转录因子至少有7种，即TAIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF、TFIIH、和TFIIJ。TFIID：TBPTATA-bindingprotein，

+TAFsTBP相关因子（TBP－associatedfactors,TAF）RNA聚合酶I的转录因子需要两种转录因子

上游结合因子（upstreambindingfactor,UBF）

选择因子1（SL1）

4种蛋白质组成，包括TATA框结合蛋白（TATA-bindingprotein，TBP）

UBF：特异地识别核心启动子和上游调控元件（UCE）中富含GC对的区域。

SL1：单独并没有识别特异DNA序列的功能，在UBF和DNA结合后，SL1才可结合上来。只有当两种辅助因子与DNA结合后，RNA聚合酶I才能与核心启动子结合，从而起始转录。InitiationofpolⅠgene’stranscriptionUBFUBFSL1POLⅠNOTE:UBF----upstreambindingfactorSL1----selectivityfactorRNApolⅢ的转录因子两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子

TFⅢA一种含9个锌指结构的蛋白

TFⅢB

由TBP和BRT、B”等蛋白构成

TFⅢC至少5个亚基以上

TFⅢB和TFⅢC是几类RNApolⅢ共同需要的转录因子

TFIIIA因子主要是针对5SrRNA的转录来讲常用。

TFⅢB是真正的转录起始因子，A和C仅仅是组装因子，作用是协助TFIIIB的定位。一般模式TheRoleofTBP

三种RNApol的转录起始均需要TBP★所有RNApolⅢ的转录起始都需要TBP★在RNApolⅠ的转录起始过程中,TBP是SL1的组份，起定位RNApolⅠ的作用★RNApolⅡ的转录起始由TBP识别TATA框

TBP起定位作用,所以又称定位因子（positioningfactor）SpecificityofTBPdependsonassociatedTAFsDNA结合域果蝇克隆基因产物组装的TFIIDRNApolymerasesarepositionedatallpromotersbyafactorthatcontainsTBP.TBPisauniversalfactorTBP非常保守，TATAbox结合域位于其C端，富含碱性氨基酸，N端分化很大可结合很多TAFs。TBP结合于TATA框小沟，含有TATAbox的启动子需要TBP，不含TATAbox的启动子也需要TBP。TheTAFII250andTAFII150helptheTFIIDbindtotheinitiatorandDPEofpromotersAlsoaidinTFIIDinteractionwithSp1thatisboundtoGCboxesupstreamofthetranscriptionstartsiteTheyenableTBPtobindto:TATA-lesspromotersthatcontainelementssuchasaGCbox---RNApolII+>20TFIIs

逐级组装

TIC→转录启动

(TranscriptionalInitiationComplex)TBPControlUPE（upstreampromoterelements）effectforbasictranscriptionTFIID：Asortofproteincomplex(TBP&>8TAF)II类基因转录起始复合物的组装及起始TATA+1

Wildsminorgroove

TFIIATBPofD

pre-TIC

TFIIA：BindstoTFIIDEnhancesTFIIDbindingtoTATAboxStabilizingtheDNA-TFIIDcomplex

TFIIB

BasicTIC

TFIIB;OnceTFIIDhasboundtoDNA,TFIIBbindstoTFIIDandbindstoTBPofTFIIDandRNApol.IITFIIF;IncludingtwosubunitsofRAP30,RAP74BindingandrecruitingRNApolIItoassembleTICPromotingRNAelongationbyitshelicase(ATPase)

A,DTFIIFRNApolIITFIIH;Largecomplexmadeupof>5subunitsHelicaseactivity(ATPase)&kinaseactivity

PhosphorylationofCTDofRNApolIIO

DNArepair

TFIIE;AssociatewithTFIIHkinase

completeTIC

EHmRNA

Promoterclearance

EHBDATranscriptionstartingTATA+1

Wildsminorgroove

TFIIATBPofD

pre-TIC

TFIIFRNApolIITFIIB

BasicTIC

conclusionmRNA

Promoterclearance

EHBDATranscriptionstartingcompleteTIC

EHRNA聚合酶II的延伸因子TFIIsRNA聚合酶并非以固定速率转录，有时会在某地暂停，TFIIs的作用可能是限制RNA聚合酶的暂停，促进转录延伸。促进RNA聚合酶的校对功能。RNA聚合酶II的转录激活因子通用转录因子只能低水平的起始转录，激活因子对于转录起始频率和基因的时空表达都有调节作用。EnhancersandSilencersTheseareposition-andorientation-independentDNAelementsthatstimulateordepress,respectively,transcriptionofassociatedgenesAreoftentissue-specificinthattheyrelyontissue-specificDNA-bindingproteinsfortheiractivitiesSomeDNAelementscanacteitherasenhancerorsilencerdependingonwhatisboundtoit例识别CAATbox的一系列因子称为CTF家族。海胆的卵中，组蛋白基因H2B启动子中含有2个CAATbox，这个基因仅仅在精子发生时表达。而从睾丸和胚胎中都有CAAT结合蛋白可以分离，却只有睾丸中的CAAT结合蛋白才能结合CAATbox，胚胎中则不行。原因在于睾丸内CTF因子可以激活H2B基因转录，而胚胎中的CTF因子被CDP（CAAT取代蛋白）抢先占据了启动子位置，阻止了起始复合物的组装，导致转录无法进行。增强子

位于启动子上游或下游甚至基因内的一段DNA顺序，它可以增强启动子发动转录的作用，从而明显地提高基因转录的效率。增强子的功能及作用特点1）能远距离增强启动子的活性；2）在启动子的上游和下游均起作用；3）无方向性；4）对启动子的影响无严格的专一性。ActivatorscanstimulateorinhibittranscriptionbyRNApolymeraseIIThestructureofthemiscomposedofatleast2functionaldomainsDNA-bindingdomainTranscription-activationdomainManyalsohaveadimerizationdomainActivatorsDNA-BindingDomainsDNA-bindingdomainshaveDNA-bindingmotifPartofthedomainhavingcharacteristicshapespecializedforspecificDNAbindingMostDNA-bindingmotifsfallinto3classes1stZincfingerThereareatleast3kindsofzinc-containingmodulesthatactasDNA-bindingmotifsAlluseoneormorezincionstocreateashapetofitana-helixofthemotifintotheDNAmajorgroove在进行TFIIIA和几种其它的DNA结合蛋白的氨基酸序列分析时，发现相同的、重复的氨基酸序列。这个大约含有30个氨基酸的序列折叠成一种包含四面体配位的锌离子的结构，这样的结构称之锌指锌指目前发现了三种：Cys2/His2型、Cys2/Cys2型和2锌离子型Zn位于Cys2和His2组成的四面体中单个锌指的三维结构是由一个α螺旋和一个β折叠片组成的a螺旋与DNA双螺旋的大沟接触来调控转录Cys2/His2型共有序列为：Cys--X2-4--Cys--X3--Phe--X5--Leu--X2--His--X3-5—HisCys2/Cys2型共有序列为：Cys—X2--Cys—X1-3--Cys—X2–Cys酵母的GAL4型蛋白：6个Cys和2个Zn，与大沟结合，二聚化位点紧邻DNA结合域成a螺旋。并非所有锌指蛋白都是DNA结合蛋白，有些则可与RNA结合，有些则没有任何关系。2ndhelix-turn-helix同源异型域，一类DNA序列编码60个氨基酸，几乎在所有真核生物中都有。含有3个a螺旋，第2，3个螺旋成h-t-h型结构3rdbZIPandbHLHMotifsAnumberoftranscriptionfactorshaveahighlybasicDNA-bindingmotiflinkedtoproteindimerizationmotifsLeucinezippersHelix-loop-helixExamplesinclude:CCAAT/enhancer-bindingproteinMyoDprotein一个HLH结构是由一个短的α-螺旋通过一个环与另一个长的α-螺旋组成的。HLH二聚体也有亮氨酸拉链区，两个HLH可以是相同的（形成同源二聚体），也可以不同（形成异源二聚体）。但与DNA结合的是从二聚合区分开的两个含有许多碱性氨基酸残基的α-螺旋。缺少与DNA结合所需要的碱性区蛋白是bHLH活性的显性失活阻遏物（dn-HLH）。Leucinezippers许多转录因子常常是以二聚体的形式识别和结合DNA的靶位点这种二聚体一部分是疏水区，另一部分是亲水区，可以说是一种“兼性”的二聚体。疏水区是两个相同α-螺旋序列靠疏水相互作用彼此缠绕形成的二聚体区。亲水区是负责与DNA结合的部分，这部分是分开的两个α-螺旋，螺旋中含有很多碱性氨基酸残基。整个二聚体结构象一个倒置的Y疏水区中的两个α-螺旋序列的最大特点是螺旋中每隔6个氨基酸残基就出现一个亮氨酸残基，由于α-螺旋中每一转含有3.4个氨基酸残基，所以第7个氨基酸残基基本上是处于螺旋的同一侧面，这样的相邻α-螺旋中