生物化学-第二章-后-课件

第一节蛋白质的构件-氨基酸第二节蛋白质的共价结构第三节蛋白质的三维结构第四节结构与功能的关系第五节蛋白质的通性、纯化和表征

第四节蛋白质结构与功能的关系一肌红蛋白结构与功能血红蛋白的结构与功能血红蛋白的分子病免疫系统与免疫球蛋白氨基酸序列和生物学功能一、肌红蛋白结构与功能的关系(一)肌红蛋白的三级结构(二)辅基血红素(二)辅基血红素(三)O2与肌红蛋白的结合(四)O2的结合改变肌红蛋白的构象(五)肌红蛋白结合氧的定量分析(氧结合曲线)MbO2↔Mb+O2K={[Mb][O2]}/[MbO2](1)Y=[MbO2]/{[Mb]+[MbO2]}(2)Y=[O2]/{[O2]+K}将（1）改写为：

[MbO2]={[Mb][O2]}/K并代入（2）得：Log[Y/(1-Y)]=logp(O2)−logKY=[O2]/{[O2]+K}=p(O2)/{p(O2)+K}YK=p(O2)−Yp(O2)=p(O2)(1−Y)Y/(1−Y)=p(O2)/K

二、血红蛋白的结构与功能(一)血红蛋白的结构(二)氧结合引起的血红蛋白构象变化肽链的一级结构标出的离子键空间结构标出的离子键一个配体与蛋白质上的一个结合部位结合影响同一蛋白质上其他结合部位的亲和力，称为别构效应。具有这种调节作用的蛋白质，称为别构蛋白质能使蛋白分子发生别构作用的物质称为效应物或调节物。(三)血红蛋白氧合的协同性和别构效应)*协同效应(cooperativity)一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应

(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应

(negativecooperativity)(三)血红蛋白的协同性氧结合(Hb氧结合曲线)血红蛋白与氧结合时会发生结构变化

TR(三)血红蛋白的协同性氧结合(Hb氧结合曲线)70%释放非常少释放血红蛋白的协同性使其更发挥其运输氧的功能(三)血红蛋白的协同性氧结合(Hb氧结合曲线)n=1没有协同性

n<1负协同性

n>1正协同性完全协同（四）.BPG降低血红蛋白对氧的亲和力磷酸甘油酸2.3-二磷酸甘油酸:结合在T态血红细胞亚基之间的腔中,腔由带正电荷的氨基酸残基所环绕,能与BPG上的负电荷相互作用不同,血红蛋白四聚体只与1分子2.3-二磷酸甘油酸结合;不需要辅基人的某些生理性和病理性缺氧可以通过红细胞中BPG浓度的改变来调节对组织的供氧量γ链的143位为丝氨酸，而β链的143位为组氨酸,胎儿血红蛋白结合BPG的能力减弱,结合O的能力增强(五）H+、CO2对血红蛋白结合氧的影响H+、CO2

促进O2的释放(Bohr效应)血液中CO2与碳酸氢盐相互转化对于调节氧的结合与释放是非常重要的.CO2+H2OH2CO3H+HCO3HbO2+HHbH+O2pH和CO2浓度对血红蛋白结合及释放O的影响称为波尔效应-+++H+、CO2

促进O2的释放(Bohr效应)三、血红蛋白分子病

(一)分子病是遗传的

正常两个亚基的第6(二)镰刀状细胞贫血病

(三)地中海贫血

地中海贫血症可以由几条途径产生：（1）缺失一个或者多个编码血红蛋白链的基因；（2）所有基因都可能存在，但一个或者多个基因发生无义突变，或者发生移码突变（3）所有基因都可能存在，突变影响了转录或者mRNA加工

(三)地中海贫血

1.β地中海贫血每条染色体有1个拷贝，β链丢失或者不能表达，纯合子会在童年夭折（γ链）。杂合子症状较轻。2.α地中海贫血

每条染色体有2个拷贝，只要有1个拷贝正常，就不会有严重症状。4个拷贝均丢失会在出生前后死亡。(一)免疫系统免疫学的含义

免疫是指机体识别并清除从外环境中入侵的病原体及其毒素,和内环境中因基因突变产生的异常细胞,保持内环境稳定的功能。

免疫学是研究免疫系统结构,免疫的机制,及利用免疫的方法预防和治疗疾病的学科。四免疫系统与免疫球蛋白免疫反应包括两个系统:体液免疫系统和细胞免疫系统通过分泌可溶性抗体清除特定抗原的途径称体液免疫。通过免疫细胞与受感染细胞结合而清除受感染细胞的途径称细胞免疫.

免疫应答涉及淋巴细胞（B细胞和T细胞）以及巨嗜细胞B细胞产生抗体（免疫球蛋白）能引起免疫应答的任何分子或病原体（病毒、细菌细胞壁、蛋白质或者其他大分子），称为抗原(二)免疫球蛋白的结构和类别免疫球蛋白的结构免疫球蛋白G(IgG)是一类最简单的免疫球蛋白。IgG含有两条相同的重链(heavychain)和两条相的轻链(lightchain)。四条链通过二硫键共价联接成Y字形结构。每一免疫球蛋白分子含有二个抗原结合部位，它们位于Y形结构的二个顶点。(三)基于抗原-抗体相互作用的生化分析方法酶联免疫ELISA样品吸附到惰性表面免疫印迹测定（Western杂交）

第一节蛋白质的构件-氨基酸第二节蛋白质的共价结构第三节蛋白质的三维结构第四节结构与功能的关系

第五节蛋白质的通性、纯化

和表征

第五节蛋白质的通性、纯化和表征

酸碱性质胶体性质和沉淀性质蛋白质的分离纯化蛋白质分子的大小与形状一蛋白质的酸碱性质

1、两性电解质

2、等电点

3、电泳

一酸碱性质

1、两性电解质

蛋白质分子中除N端的-氨基，C端的-羧基外，还有许多可解离的侧链基团。如-羧基，-羧基，-氨基，咪唑基，胍基，等，所以是两性电解质。

各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。

当蛋白质在某一pH溶液中，酸性基团带的负电荷恰好等于碱性基团带的正电荷，蛋白质分子净电荷为0，在电场中既不向阳极移动，也不向阴极移动，此时溶液的pH值称为该蛋白的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀压和导电能力均为最小。一酸碱性质

2、等电点蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。

第五节蛋白质的通性、纯化和表征

酸碱性质胶体性质和沉淀性质蛋白质的分离纯化蛋白质分子的大小与形状二胶体性质和沉淀性质-应用价值

(一)胶体性质1、蛋白质为大分子，分子量1万-100万，形成的颗粒直径为1-100nm，属于胶体范围。

蛋白质水溶液为稳定的亲水胶体溶液(一)胶体性质

蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的净电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定的距离，不至于相互凝聚沉淀。

蛋白质分子表面的亲水基团，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质表面形成一个水化层。使蛋白质颗粒互相隔开，不会碰撞形成大颗粒。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜酸碱酸碱胶体性质布朗运动

电泳现象

吸附现象

不能透过半透膜

利用其特性可以进行蛋白质的分离，纯化。(二)沉淀性质

概念：蛋白质具有胶体性质，因而破坏胶体稳定性（如破坏水化膜，中和电荷等）因素（如盐、有机溶剂等），可使蛋白质溶液变得不稳定而沉淀，这种现象称为蛋白质的沉淀反应。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉

1高浓度中性盐沉淀反应

–可逆的（蛋白不变性）

加入高浓度的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）可破坏蛋白质的水化层（脱水），中和蛋白质的电荷，从而使蛋白质沉淀析出

2有机溶剂

–或可逆（短时间、低温可逆）

丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层（这些溶剂与水亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上的水膜，使蛋白质溶解度降低而沉淀，在等电点时加入有机溶剂更容易使蛋白沉淀）。不同蛋白质沉淀所需的有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度可使混合蛋白质达到分级沉淀的目的

3重金属盐–不可逆

当溶液pH值>等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，就容易与Hg2+、Ag+、Pb2+Cu2+等金属离子结合成不易溶解的盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白进行解救（因蛋白能与重金属离子形成不溶性盐，再服用催吐剂将其排除体外）。

4生物碱试剂和某些酸类物质–不可逆当溶液pH值<等电点时，蛋白颗粒带正点，能与苦味酸、单宁酸等生物碱试剂（能与生物碱生成沉淀或产生颜色反应的试剂）或某些酸如三氯乙酸、硝酸等的负离子根反应生成不溶性盐而析出。

5加热变性沉淀

几乎所有的蛋白质都因加热变性，少量的盐类可以促进其凝固。我国很早就用这一性质制豆腐（大豆蛋白质浓溶液加热并加入少量盐卤，含MgCl2）。等蛋白质处于等电点时，凝固会更完全或迅速。

第五节蛋白质的通性、纯化和表征

酸碱性质胶体性质和沉淀性质蛋白质的分离纯化蛋白质分子的大小与形状

三蛋白质的分离纯化（一）蛋白质分离纯化的一般原则（二）蛋白质分离纯化的方法

（一）蛋白质分离纯化的一般原则

1、前处理

2、粗分级分离

3、细分级分离1、前处理

要选择合适的材料(目标蛋白含量高容易分离);合适的破碎方法;合适的提取液(合适盐溶液,合适的pH值)

2、粗分级分离（分离、浓缩）多种蛋白质混合物,纯度不高要方法简便，处理量大。常用高浓度盐(盐析)、等电点沉淀和有机溶剂分离等方法。这些方法的优点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适合用沉淀法或盐析法浓缩，可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。3、细分级分离（样品的进一步纯化）主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。结晶既是纯度的标志，也是断定样品处于天然状态的有力指标。（二）蛋白质分离纯化的方法

1、根据蛋白质分子大小的差别的分离

2、根据蛋白质溶解度不同的分离

3、根据蛋白质带电性质进行分离

4、根据配体的特异性分离

5、高效液相层析和快速蛋白液相层析1、根据蛋白质分子大小的差别的分离

1）透析与超过滤

2）凝胶过滤法1).透析和超滤透析透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。

超滤：

利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。

超滤是一种膜分离技术，它的特点是使用不对称多孔膜根据分子的大小来分离溶液中的大分子物质与小分子物质。超滤尤其适用于大分子溶液的浓缩、不同种类分子的纯化以及溶剂交换等。超滤法是一种温和、非变性的物理方法，比其它分离方法有效率更高、更灵活的优点。超滤的主要应用：浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过，从而达到浓缩的目的。

梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法，适用于分离相对分子质量相差10倍以上的分子组分。在超滤过程中，虽然截留的大分子被浓缩，但滤过的溶质分子仍保持初始的浓度。

脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。通过溶剂交换，可最有效地去除溶液中的小分子物质，并逐渐分离纯化出大分子物质。具体方法为：在溶液进行超滤的同时，不断向溶液中补充溶剂，补充溶剂的速度与溶液滤过速度相同，使体系始终保持恒定，这种方法又称透析超滤法。2)凝胶过滤（分子排阻层析或分子筛层析）当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。1,3糖苷键1,6糖苷键环氧丙烷这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。凝胶过滤是一种柱层析，柱中的填充物是大分子的惰性聚合物，最常用的有葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名为.Sepharose）2、根据蛋白质溶解度不同的分离

1）蛋白质的盐析

2）低温有机溶剂沉淀法1）蛋白质的盐析加入高浓度的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）可破坏蛋白质的水化层（脱水），中和蛋白质的电荷，从而使蛋白质沉淀析出的现象,此现象叫盐析在一定范围内,蛋白质随稀中性盐溶液浓度增大，其溶解度也逐渐增大，此现象称为盐溶。（低盐可使蛋白质表面吸附某种盐类离子，导致其颗粒带同性电荷增加而相互排斥加强，并于水分子作用增加，从而溶解度提高）

影响盐析的因素有：温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低。pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。2）低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。（1）降低水溶液的介电常数，离子化程度降低,使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。3、根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质等点电不同；蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1）电泳法

2）离子交换层析法1）电泳法

在外电场的作用下，带电颗粒，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）因分子量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing,IEF），利用pI不同，以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止。电泳双向电泳：2）离子交换层析法纤维素离子交换剂（具有较松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过，容量大；纤维素糖残基上的羟基被取代的百分比较低，电荷密度比较小，所以洗脱条件温和，蛋白回收率较高）离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；）离子交换原理及流程示意图4、亲和层析法(根据配体的特异性分离)亲和层析法（aflinitychromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力，建立起来的一种有效分离蛋白质的方法。亲和层析法的基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体（载体能允许蛋白质通过）表面的