傻瓜RT-PCR反应体系（Easy-GoRT-PCRPreMix）

傻瓜RT-PCR反应体系（Easy-Go™RT-PCRPreMix）实验方法据下表将适当浓度的模板RNA和反向引物混合在DEPC处理过的管中。模板RNA和引物在反应体系中的浓度反应体系20µl反应体系模板RNA总RNA0.5-1.0µgPoly(A)RNA0.05-0.1µg引物引物10-30pmol2.DEPC处理水补足到20ul。3.通过振荡将冻干物完全溶解，然后轻微离心。4.加少许矿物油（若使用带加热盖的PCR仪，可省略此步骤）。5.根据下列推荐的条件进行cDNA合成。42℃，60分钟（94℃6.根据PCR反应条件进行PCR反应（退火温度及时间需要针对不同的引物/模板组合加以优化）。常见问题及参考意见RNA结构特点及RNase的作用？RNA是由4种（2’未脱氧的）核苷酸A、U、G、C的单链构成的聚合物。2’-OH对RNA分子的理化性能有重要影响：（1）RNase对RNA的降解作用通过2’-OH进行，不再需要DNase必须的工作金属离子的参与便可完成；（2）RNA分子在强碱条件下，通过2’-OH参与形成2’操作RNA注意事项？由于RNA酶的高稳定性、广泛存在性和RNA的不稳定性，在有关RNA操作的实验中须十分小心。指定特定的区域作为操作RNA专用区，保持实验室低温、清洁的环境，减少空气流动，实验前用RNA酶灭活剂和75%乙醇檫试实验台。实验过程中需戴口罩及一次性手套，接触可能污染RNA酶的物品后要更换手套。对于内源RNase的抑制，根据实验特点采取不同方法。如体外转录、合成cDNA第一链等实验，加入RNase的专一抑制剂（RNasin）；对于RNA的分离制备采用非特异的蛋白变性剂，如异硫氰酸胍-巯基乙醇联合变性的方式等。对于外源RNase，凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等，通常用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液37℃浸泡12小时以上，高温灭菌并烘干后使用。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。所用玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上或实验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。注意：DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。用作RNA分析的电泳槽要用1%SDS清洗，用水冲洗后，然后用无水乙醇清洗，最后用3%双氧水浸泡10分钟。使用前再用DEPC处理水冲洗电泳槽。cDNA产量很低，为什么？可能的原因：（1）RNA模板质量低；（2）对mRNA浓度估计过高；（3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；（4）反应体积过大，一般不应超过50µl。进行RT-PCR实验时，产生弥散条带，为什么？（1）在PCR反应体系中第一条链产物的含量过高；（2）引物的用量过高；（3）没有优化PCR反应条件及循环参数；（4）在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物，为什么？可能原因建议解决方法RNA被降解在变性胶上验证RNA的完整性使用无污染技术分离RNA将组织从动物体取出后立即处理在100%甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂会稀释所有结合的RNA中包含逆转录抑制剂通过乙醇沉淀RNA，然后用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行漂洗。逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺、甲酰胺和胍盐将对照RNA同样品混合，与对照RNA反应比较产量以检测抑制剂多糖同RNA共沉淀使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖用于合成cDNA第一链的OligoDNA没有很好退火确定退火温度是否适合您的OligoDNA。对于随机六聚体，建议在反转录保温之前先在25℃对于基因特异性OligoDNA（GSP），可以试用一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列起始RNA量不够增加RNA量对于<50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSARNA模板二级结构太多将RNA和OligoDNA在不含盐及缓冲液条件下变性、退火提高逆转录反应温度靶序列在分析的组织中不表达尝试其他靶序列或组织PCR没有起作用对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物PCROligoDNA设计较差避免在OligoDNA3’避免可以形成内部发卡结构的序列设计Tm值接近的OligoDNA目的序列不在目的RNA上重新设计实验，或尝试用其它来源的目的RNA模板GC含量太高对于GC含量>50%的模板，使用改善GC含量的优化剂模板浓度太低使用103拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号镁离子浓度太低从1mM到3mM间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和OligoDNA对的最佳镁离子浓度。注意：对于RealTimePCR，使用3mM到退火温度太高将退火温度设定为低于Tm值5℃进行PCROligoDNA浓度太低最佳OligoDNA浓度介于0.1µM到0.5µM之间特异OligoDNA（GSP）设计较差遵循OligoDNA设计原则6.进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到非特异性扩增产物，为什么？反应条件不是最佳优化镁离子浓度及退火温度。使用镁离子前将其震荡混匀。引物设计不合理确认引物无自身互补，或两条引物不互补，尤其在近3’检查PCR引物的长度和Tm。避免在引物的3’体系被另一目的RNA/DNA污染加样时使用正排式移液管