PCR技术-教学讲解课件

第五节基因扩增技术第五节基因扩增技术1第五节基因扩增技术第五节基因扩增技术1

一、PCR的定义：

PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。一、PCR的定义：2一、PCR的定义：一、PCR的定义：

PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。

KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。PCR技术：1985年由美国Cetus公司的3PCR技术：1985年由美国Cetus公司的二、PCR技术的原理1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。95℃

2.退火(复性)(Annealling):降低反应体系的温度使寡核苷酸引物与DNA模板互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。55℃也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。二、PCR技术的原理4二、PCR技术的原理二、PCR技术的原理4

3.延伸(Extension):

升高反应体系温度至72℃，以4种dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下，从引物的3′-OH端延伸，以变性后的单链DNA为模板，合成出5′→3′的互补链。

上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。3.延伸(Extension):53.延伸(Extension):

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-55˚CPCR的基本反应步骤变性延伸退火6PCR的基本反应步骤变性延伸退火PCR双链DNA分子双链DNA分子7双链DNA分子双链DNA分子7双链断开

循环1双链断开 循环18双链断开 循环1双链断开 循环18模板与引物结合循环1模板与引物结合循环19模板与引物结合循环1模板与引物结合循环19循环1TaqTaq循环1TaqTaq10循环1TaqTaq循环1TaqTaq10循环1循环111循环1循环111双链断开循环2双链断开循环212双链断开循环2双链断开循环212模板与引物结合循环2模板与引物结合循环213模板与引物结合循环2模板与引物结合循环213循环2循环214循环2循环214PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Yn=X．2n计算但在实际扩增过程中，扩增效率不可能达到100%Yn=X．（1+E）n0≤E≤1

PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Y15PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Y四、PCR的反应体系1.模板DNA：被复制的核酸片段，在用RNA作模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。2.引物：为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板有两条引物，其决定着PCR扩增产物的特异性和长度。四、PCR的反应体系16四、PCR的反应体系四、PCR的反应体系163.脱氧核苷三磷酸（

dNTP）：dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度为0.02～0.2mmol/L4.TaqDNA聚合酶：

催化DNA的合成0.5～5U/100μl，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：产物量降低3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：173.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：3.脱氧核苷三磷酸（dN5.MgCl2:

1.5～2.0mmol/L

Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。5.MgCl2:185.MgCl2:5.MgCl2:186.缓冲液：

10

～50mmol/LTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境的偏碱性25～50mmol/LKCl促进引物退火，>50mmol/L会抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。6.缓冲液：196.缓冲液：6.缓冲液：19五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作人员保护环境保护样品五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作20五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作

临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应21临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应PCR实验室平面设计○在入口处设缓冲间○缓冲间比专用走廊更有意义。PCR实验室平面设计○在入口处设缓冲间○缓冲间比专用走廊更有22PCR实验室平面设计○在入口处设缓冲间○缓冲间比专用走廊更有PCR技术--教学讲解课件23PCR技术--教学讲解课件23PCR技术--教学讲解课件24PCR技术--教学讲解课件24PCR实验室各区的设备配置表√√√PCR实验室各区的设备配置表√√√25PCR实验室各区的设备配置表√√√PCR实验室各区的设备配置2.操作人员必须进行上岗培训：卫生部临床检验中心或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临床检验中心认定的机构3.分装试剂：在超净工作台内分装，然后低温保存4.实验操作注意事项：做好个人防护避免反应液飞溅2.操作人员必须进行上岗培训：262.操作人员必须进行上岗培训：2.操作人员必须进行上岗培训：4.实验操作注意事项：应有完整、有效的去污措施实验前：实验耗材（反应管、加样器吸头）必须经高压消毒实验后：反应管、加样器吸头用10%次氯酸钠溶液消毒处理；实验台面和其他表面用10%次氯酸钠溶液或紫外线近距离照射4.实验操作注意事项：应有完整、有效的去污措施274.实验操作注意事项：应有完整、有效的去污措施4.实验操作注4.实验操作注意事项：设立阴性、阳性对照阴性对照：检查是否存在污染阳性对照：证明实验体系正常，防止假阴性4.实验操作注意事项：设立阴性、阳性对照284.实验操作注意事项：设立阴性、阳性对照4.实验操作注意事项第五节基因扩增技术第五节基因扩增技术29第五节基因扩增技术第五节基因扩增技术29

一、PCR的定义：

PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术。一、PCR的定义：30一、PCR的定义：一、PCR的定义：

PCR技术：1985年由美国Cetus公司的KaryMullis首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、法医学等领域，并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。

KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。PCR技术：1985年由美国Cetus公司的31PCR技术：1985年由美国Cetus公司的二、PCR技术的原理1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。95℃

2.退火(复性)(Annealling):降低反应体系的温度使寡核苷酸引物与DNA模板互补区域按碱基配对原则结合，形成杂交链。55℃也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。二、PCR技术的原理32二、PCR技术的原理二、PCR技术的原理32

3.延伸(Extension):

升高反应体系温度至72℃，以4种dNTP为原料，在DNA聚合酶作用下，从引物的3′-OH端延伸，以变性后的单链DNA为模板，合成出5′→3′的互补链。

上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106～109倍。3.延伸(Extension):333.延伸(Extension):

PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-55˚CPCR的基本反应步骤变性延伸退火34PCR的基本反应步骤变性延伸退火PCR双链DNA分子双链DNA分子35双链DNA分子双链DNA分子35双链断开

循环1双链断开 循环136双链断开 循环1双链断开 循环136模板与引物结合循环1模板与引物结合循环137模板与引物结合循环1模板与引物结合循环137循环1TaqTaq循环1TaqTaq38循环1TaqTaq循环1TaqTaq38循环1循环139循环1循环139双链断开循环2双链断开循环240双链断开循环2双链断开循环240模板与引物结合循环2模板与引物结合循环241模板与引物结合循环2模板与引物结合循环241循环2循环242循环2循环242PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Yn=X．2n计算但在实际扩增过程中，扩增效率不可能达到100%Yn=X．（1+E）n0≤E≤1

PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Y43PCR循环次数与DNA产量关系理论上，终产物DNA的量可用Y四、PCR的反应体系1.模板DNA：被复制的核酸片段，在用RNA作模板时，须先将RNA逆转录为cDNA，再以cDNA作为PCR反应的模板进行扩增反应。2.引物：为化学合成的寡核苷酸，每条被扩增的模板有两条引物，其决定着PCR扩增产物的特异性和长度。四、PCR的反应体系44四、PCR的反应体系四、PCR的反应体系443.脱氧核苷三磷酸（

dNTP）：dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度为0.02～0.2mmol/L4.TaqDNA聚合酶：

催化DNA的合成0.5～5U/100μl，偏高：引物非特异产物的扩增；偏低：产物量降低3.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：453.脱氧核苷三磷酸（dNTP）：3.脱氧核苷三磷酸（dN5.MgCl2:

1.5～2.0mmol/L

Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。5.MgCl2:465.MgCl2:5.MgCl2:466.缓冲液：

10

～50mmol/LTris-Cl(pH8.4)维持Taq酶作用环境的偏碱性25～50mmol/LKCl促进引物退火，>50mmol/L会抑制Taq酶的活性。

100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。6.缓冲液：476.缓冲液：6.缓冲液：47五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作人员保护环境保护样品五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作48五、注意事项1.实验室的布局要求：生物安全二级实验室保护操作

临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增反应49临床PCR实验室分区试剂储存和准备区标本制备区扩增