原位杂交技术原理及其应用教学课件

原位杂交技术原理及其应用原位杂交技术insituhybridization核酸分子杂交技术◆在研究DNA分子复制原理的基础上发展起来的一种技术。两条核苷酸单链片段,通过氢键结合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA_RNA双链分子

按其作用方式可大致分为两种:固相杂交和液相杂交液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等今固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上(常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交包括:◆菌落原位杂交(colonyinsituhybridization)

斑点杂交(Dotblot)、心Southern印迹杂交(Southernblot)◆northern印迹杂交(Northernblot)◆组织原位杂交(Tissueinsituhybridization)即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术原位杂交技术的基本原理

利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链1.两条核苷酸单链片段,在适宜的条件下,通过氢键结合,形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA双键分子2.应用带有标记的(有放射性同位素,如3H、35S32P,荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交3.用放射自显影等方法予以显示,在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在与定位ITcGATcGc-DiNAVectoTranscriptionSPAT67T?polymerase3D79en9吗iBiotinPAPAIGCUAGCc-RNAUCGAUCGm-RNA用原位杂交术,可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性,可进一步从分子水来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段InsituhybridizationAromasgeneTheratbrainsection旁桑培养细胞,原位杂交组织化学技术发展1961年,Hal液相核酸杂交技术1969年,GaI|和Pardue用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。1969年,Buongiorno-Nardelli和Amaldijohn利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位,创造了原位杂交细胞或组织化学技术0rth(1970)应用引H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探针均采用同位素标记。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成功Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍56、书不仅是生活，而且是现在、过去和未来文化生活的源泉。——库法耶夫

57、生命不可能有两次，但许多人连一次也不善于度过。——吕凯特

58、问渠哪得清如许，为有源头活水来。——