免疫组化技术-免疫荧光组织化学技术（病理检验技术课件）

病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术概述免疫荧光组织化学技术

概述

免疫荧光技术(immunofluorescencetechnique)和免疫组织化学技术相类似,也是把组织学、细胞学和免疫学结合起来的一门技术,利用免疫学反应在组织切片或细胞涂片上原位显示组织细胞中的抗原以及抗原的分布和含量,以了解相关抗原在组织和细胞中的变化及其意义。

所不同的是免疫荧光染色技术所用的抗体标记物是荧光素而不是酶,不需要显色剂和显色反应,通过激发抗原-抗体结合物上结合的荧光素发出可见荧光,用荧光显微镜观察这些可见荧光来确定是否有抗原表达。眼睛在暗视场观察抗原部位发出的荧光比在明视场观察阳性结果的颜色要敏感。免疫荧光组织化学技术

用荧光抗体检查相应抗原的方法称荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物检查相应抗原的方法称荧光抗原法。免疫荧光组织化学技术染色方法有直接法、间接法、补体法、双重荧光标记法。直接法是免疫荧光组化技术最简单和基本的方法。把荧光抗体(或抗原)滴加于待检标本片上,直接与细胞或组织中相应抗原(或抗体)结合,洗涤后在荧光显微镜下即可见抗原(或抗体)存在部位呈现特异性荧光。此法常用于细菌、病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的鉴定。其缺点是敏感性较差。间接法用已知抗体检测未知抗原时,先用特异性抗体(第一抗体,简称“一抗”)与相应抗原结合,再用荧光素标记的抗特异性抗体(第二抗体,简称“二抗”)与特异性抗体结合,在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。用已知抗原检测未知抗体时,先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应,再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合,抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间。补体法直接检查组织内免疫复合物法间接检查组织内抗原法讨论免疫荧光组织化学技术的概念。免疫荧光组织化学技术的分类。病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术免疫荧光技术操作准备免疫荧光组织化学技术

免疫荧光技术操作准备

一、组织切片

（一）组织及组织切片的保存用直接法进行免疫荧光染色的组织切片通常为冷冻切片,因此,组织不需要固定,组织离体后应该马上取材,用低温恒冷切片机切片,组织如果不马上进行冷冻切片,或冷冻切片后不马上染色,应将组织或冷冻切片放-30℃冰箱保存,如果保存时间超过1天,最好放-80℃冰箱保存。在冰箱保存时,应将组织或冷冻切片密封,防止干涸。在免疫荧光染色间接法中,组织切片可以用冷冻切片,也可以用石蜡切片。

一、组织切片（二）组织切片厚度的要求组织切片的厚度为4~5um；肾穿刺组织切片要薄,3~4um。切片太厚,除了在染色过程中容易脱片和细胞重叠影响观察诊断外,还会造成激发光过多消耗在标本下面,标本上面照射不足等,造成上下不均匀的现象。

免疫荧光技术操作准备二、组织细胞固定作冷冻切片的组织不用固定,经冷冻切片后切片用冷丙酮(4℃)固定10分钟；细胞涂片固定和冷冻切片固定相同。石蜡切片组织固定与免疫组化染色相同。

免疫荧光技术操作准备三、玻片选择常用的普通玻片或多或少都会产生自发荧光,如果玻片清洗干净,影响不会很大。理想的是选用专用的无荧光载玻片和干涉盖玻片,干涉盖玻片的作用是选择性让荧光通过,避免其他光通过干扰荧光图像。切片时应贴在硅化或涂胶玻片上,防止染色时脱片。

免疫荧光技术操作准备四、缓冲液选择在免疫荧光染色中,最常用、配制简单的首选缓冲液是pH7.4的磷酸盐生理盐水缓冲液PBS,用于稀释抗体和浸洗切片；最好选用与抗体同一生产厂生产的抗体稀释液稀释抗体。五、实验对照设立

与免疫组化染色相同。

免疫荧光技术操作准备六、抗原修复

用冷冻切片进行免疫荧光直接法染色一般不需要行抗原修复处理。如果是石蜡切片用间接法进行免疫荧光染色,是否行抗原修复,则按照每一种不同的抗体说明书要求来进行，井非所有的抗体染色前都需要进行抗原修复。

免疫荧光技术操作准备七、血清封闭

直接法染色一般不需用血清封闭；间接法染色时,需要根据二抗的种类选择相应的正常非免疫血清封闭组织。

免疫荧光技术操作准备八、抗体选择

荧光素标记的二抗大多是含单一种动物的兔疫球蛋白,或鼠或兔或羊,因此,需要根据一抗的动物源性来选择相应的二抗配套使用,如选择不对,则抗体连接不上,染色就失败。

免疫荧光技术操作准备九、组织背景复染免疫荧光染色后一般不需要行组织背景的复染。如果FITC标记抗体染色有非特异性荧光背景染色,可用伊文思蓝试剂作复染,背景呈红色荧光。伊文思蓝复染适用于结果为亮黄绿色荧光的FITC标记抗体的染色,而不适合结果为橙红色荧光的TRITC标记抗体的染色。伊文思蓝复染是在抗体孵育经PBS洗后进行,复染后再经PBS洗,然后封片。伊文思蓝试剂的配制：伊文思蓝(evansblue)0.01g0.01mol/LPBS(pH7.4)100ml

免疫荧光技术操作准备十、封片与封片剂切片染色后不需要脱水透明,可以直接用缓冲甘油封片剂封片。最好选用商品化的专用荧光染色封片胶,可避免封片剂内自发荧光的干扰。缓冲甘油的配制：1.0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0)Na2CO30.53gNaHCO33.78gH2O100ml必要时用1mol/LHCl或1mol/LNaOH调至pH9.0。

免疫荧光技术操作准备十、封片与封片剂2.缓冲甘油0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0)1份甘油(丙三醇)

9份用FITC标记抗体时,常用0.5mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0)来溶解荧光素和稀释抗体,FITC在pH8.5~9.5的碱性环境下发出荧光效果最好,所以一般用碳酸盐缓冲液(pH9.0)来配制缓冲甘油,也可以用0.01mol/LPBS(pH7.4)配制。

免疫荧光技术操作准备十一、标本保存经免疫荧光染色后应及时观察,否则荧光会慢慢减弱,如果不马上观察,染色片应放冰箱(低温、暗处)保存,可延缓荧光衰减。

免疫荧光技术操作准备病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术免疫荧光染色方法及操作免疫荧光组织化学技术

免疫荧光染色方法及操作

一、免疫荧光染色方法(一)直接法用荧光素标记的一抗直接与组织细胞特异性结合，即可在荧光显微镜下观察结果，直接法中只有抗原抗体特异性结合，没有连接其他抗体，所以特异性极高，非特异性染色少。但由于没有将抗原一抗体结合物放大，所以敏感性不及间接法。

免疫荧光染色方法及操作(一)直接法将抗体标记上荧光素→荧光抗体与组织细胞抗原结合→形成有荧光素的抗原-抗体结合物→激发光(紫外光)照射,荧光素发出可见荧光→荧光显微镜观察。1.特点

最大的优点是操作步骤少,染色快速,几乎没有非特异性背景染色;缺点是抗体种类不多。目前荧光一抗主要用于肾穿刺和皮肤的病理诊断,多数是兔源抗体,标记FITC。2.检测试剂盒

不需检测试剂盒,只需要选择目的荧光标记的一抗。免疫荧光染色方法及操作3.染色步骤(1)冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗,PBS洗。(2)滴加荧光标记一抗工作液孵育45分钟,37℃。(3)PBS洗5分钟,3次。(4)晾干或甩去PBS用缓冲甘油封片。4.结果

阳性结果荧光呈明暗不一的亮黄绿色(FITC标记抗体)或橙红色(TRITC标记抗体)。免疫荧光染色方法及操作(二)间接法先用目的一抗与抗原特异性结合,再加入荧光素标记的二抗与一抗连接,然后在荧光显微镜下观察结果。间接法中加入二抗,将抗原-抗体结合物进一步放大,所以敏感性较高。将第二抗体标记上荧光素→第一抗体与组织抗原结合→第二抗体与第一抗体结合→形成有荧光素的抗原-抗体结合物→激发光(紫外光)照射荧光素发出可见荧光→荧光显微镜观察。免疫荧光染色方法及操作1.特点在染色中加入荧光素标记的二抗与一抗结合,使抗原一抗体结合物不断放大，敏感性较高。一抗不需标记荧光素,和兔疫组化染色一样可选择的一抗种类多,用一个检测试剂盒就可以分别检测各种抗原。间接法除了用冷冻切片外,还可以用石蜡切片。2.测试剂盒没有专门做免疫荧光染色的检测试剂盒,通常是根据所用的一抗选择单一的荧光素标记二抗。目前可供选择的主要有标记FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及TRITO标记的抗兔和抗鼠二抗,必要时还可以选择非免疫正常血清,可供选择的封闭用正常血清有羊、兔和马血清。免疫荧光染色方法及操作3.染色步骤(1)石蜡切片脱蜡至水,冷冻切片和细胞涂片固定后蒸馏水洗。(2)必要时石蜡切片进行抗原修复,修复后蒸馏水洗。(3)必要时进行正常血清封闭10分钟,甩去血清,不洗。(4)滴加一抗工作液孵育30~60分钟,37℃；或孵育过夜(约16小时),4℃。(5)PBS洗5分钟,3次。(6)滴加荧光素标记二抗孵育30分钟,37℃。(7)PBS洗5分钟,3次。(8)晾干或甩去PBS用缓冲甘油封片。4.结果

阳性结果荧光呈明暗不一的亮黄绿色(FITC标记二抗)或橙红色(TRITC标记二抗)。三、免疫荧光染色质量控制免疫荧光染色质量控制与免疫组织化学染色质量控制基本相同。此外,免疫荧光染色后,染色片放置时间长荧光会慢慢衰减,因此,应及时观察,否则荧光衰减会导致阳性强度的错误判断或出现假阴性。观察时,光源长时间照射标本,会加快荧光淬灭,应避免长时间观察同一标本。如果用石蜡切片行免疫荧光染色,则必须彻底脱蜡,否则石蜡会有青色荧光发出,影响观察。免疫荧光染色方法及操作病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术荧光素标记的抗体免疫荧光组织化学技术

荧光素标记的抗体

一、抗体的标记荧光素异硫氰酸荧光素和四甲基异硫氰酸罗丹明B均含有硫碳胺键(一NCS),在标记抗体时硫碳胺键与抗体蛋白的氨基(一NH2)结合,形成较为牢固和稳定的荧光素-蛋白质结合物(荧光抗体)。

免疫荧光组织化学技术

荧光素标记的抗体

一、抗体的标记一个抗体免疫球蛋白分子可与3~8个分子的FITC结合,在临床病理诊断中,主要使用商品化的荧光抗体。

荧光素标记的抗体二、标记抗体的类型荧光素可以标记一抗,也有标记二抗,商品化的荧光一抗的抗体标记荧光素主要是FITC,大都是用于肾脏和皮肤组织病理诊断的兔多克隆抗体。标记一抗用于直接法荧光素标记的抗体二、标记抗体的类型

标记二抗抗体的荧光素有FITC和TRITC,所标记的二抗有抗鼠lg和抗兔Ig两种,与鼠源和兔源一抗配套使用。荧光素标记二抗用于间接法荧光素标记的抗体利用两种荧光素FITC和TRITC发出两种不同颜色的荧光(黄绿色和橙红色),可配合使用进行免疫荧光双重染色。讨论荧光素标记抗体的类型及应用？病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术荧光显微镜免疫荧光组织化学技术

荧光显微镜

免疫荧光染色后,染色结果需要通过荧光显微镜观察来进行病理诊断。荧光显微镜是免疫荧光技术中重要的工具,光源给出特定波长的激发光激发标本发出荧光,通过物镜和目镜观察组织细胞中的荧光图像。激发滤片是荧光显微镜的重要部件,不同的激发滤片可让不同范围波长的激发光通过,所以选择不同的激发滤片可获得一定波长范围的激发光。

免疫荧光组织化学技术

荧光显微镜

因此,需要根据抗体所标记的荧光素来选择合适的激发滤片,以获得合适的激发光。显微镜的分辨率与光源波长的长短成反比,荧光显微镜光源为紫外光的波长比可见光短,所以比普通光学显微镜分辨率高。

一、激发滤片的选择荧光显微镜

一般的荧光显微镜配有紫外、蓝色、绿色和紫色激发荧光滤光片组。激发滤片也有厚、薄两种,厚激发滤片可使荧光显微镜观察视场为暗视场,薄激发滤片为较明亮视场。激发滤片的选择要使荧光明亮而背景适中,背景太亮,会影响荧光的观察；背景太暗,则看不到组织细胞结构。一、激发滤片的选择荧光显微镜

1.UV激发滤片通过的激发光波波长为330~400nm。2.V

激发滤片通过的激发光波波长为395~415nm。3.B激发滤片通过的激发光波波长为420~485nm,主要用于FICT荧光素标本的观察。一、激发滤片的选择荧光显微镜

4.G激发滤片通过的激发光波波长为460~550nm,主要用于TRICT荧光素标本的观察。由于FITC和TRITC为最常用的抗体标记荧光素,所以,一些牌子的显微镜专门生产配套有FITC专用激发滤板如KP490滤板和TRITO专用激发滤板如S546滤板。二、荧光显微镜的使用1.要提前打开荧光显微镜电源,超压汞灯开启15分钟后光源稳定,适合观察。开启光源后每次使用不超过2小时,超过2小时光亮强度逐渐下降,观察到的荧光也会变弱。关闭光源后需要等灯泡冷却后才能再次开启,否则影响灯泡寿命。荧光显微镜二、荧光显微镜的使用2.荧光显微镜应安装紫外光挡板或在观察时戴上防护眼镜,防止紫外光损害眼睛。3.用高倍油镜观察时,应选用无荧光镜油,避免非特异性荧光干扰。4.拍摄荧光图像时,应选用较高的lSO感光度模式。荧光显微镜病理检验技术

免疫组化技术免疫荧光组织化学技术荧光与荧光素免疫荧光组织化学技术

荧光与荧光素

在免疫荧光技术中,荧光显微镜电光源发出激发光,将标记在抗体上的荧光素激发出荧光,通过荧光显微镜观察荧光图像。

荧光与荧光素

一、荧光在一定波长的光如紫外光等照射后,某些物质吸收照射光后被激发出的比照射光波长更长的可见光,称为荧光(fluorescence)。荧光寿命很短,一般约为10-9~10-8秒,所以当紫外光停止照射后荧光便马上消失,但这种消失并非为荧光淬灭现象。荧光与荧光素

一、荧光荧光淬灭是指标记了抗体的荧光素或与组织细胞结合的荧光染料,在染色过程中与各种试剂的作用,长时间保存尤其是在高温环境或经过长时间紫外光照射后,使荧光素被激发出荧光的能力减弱,甚至消失。因此,免疫荧光染色结果难以长时间保存。荧光与荧光素

荧光可分为以下两种:（一）诱发荧光一些物质本身不能发出荧光，但经过标记荧光素或经荧光染料染色后,经过紫外光照射激发荧光素或经荧光染料发出的荧光称为诱发荧光。经免疫荧光染色后观察到的组织细胞中的荧光属于诱发荧光。（二）自发荧光一些物质如血红蛋白等本身在紫外光照射后,能发出荧光,这种荧光称为自发荧光。自发荧光相对较弱,但也是造成免疫荧光非特异性染色的原因之一。二、激发光激发光是由荧光显微镜光源发出,激发