特殊染色技术-糖类染色法（病理检验技术课件）

病理检验技术

特殊染色

糖类糖类概述糖类

糖类广泛存在于动植物中,其化学成分复杂,在生化活动中参与的范围较广,分类也较杂,很多还不十分了解。除含糖外还有不同的反应基团。糖类根据其水解后生成的物质，以及所含的基团主要可区分如下:

一、单糖和双糖单糖不能再水解,而双糖能水解成二分子的单糖。单糖和双糖都易溶于水,在组织固定过程中全部溶解脱失。糖类

单糖结构

双糖结构二、多糖多糖(polysaccharides)是单糖分子以苷键结合成大分子的化合物,分子量从几万至几百万。多糖又分为淀粉、纤维素和糖原,前两者主要存在于植物界。糖原又称为动物淀粉是存在于动物组织的糖,以肝脏和骨骼肌含量最多,含有乙二醇基,由上千个葡萄糖单位组成。糖类

多糖结构糖类

三、黏多糖黏多糖(mucopolysaccharides)又称黏液物质(mucosubstances）,是含氮的多糖,根据其是否含酸根或所含酸根的不同,又分为中性黏多糖(中性黏液物质)和酸性黏多糖(酸性黏液物质)两大类。(一)中性黏液物质(neutralmucosubstances)含有氨基己糖和游离的己糖基,但不含任何酸根,故称中性黏多糖。它见于胃黏膜的表面上皮、十二指肠腺和前列腺上皮。其反应基是乙二醇基或氨羟基。中性黏液物质PAS反应阳性,用其他黏液染色法进行染色多数不着色。糖类

(二)酸性黏液物质(acidmucosubstances)含有氨基己糖和酸根,可分为硫酸化黏液物质和非硫酸化黏液物质。1.硫酸化黏液物质含有氨基己糖,并含有各种酸根,此类又分为以下两种(1)强硫酸化结缔组织黏液物质:含有含硫酸根的葡萄糖醛酸,如硫酸软骨素A、B和C、硫酸肝素和硫酸角质素。(2)弱硫酸化上皮性黏液物质:也含硫酸根,但其结合和上述有所不同。糖类2.,非硫酸化黏液物质含氨基己糖,不含硫酸根，根据该黏液物质含己糖醛酸或唾液酸,以及见于结缔组织或上皮而分为以下两种：(1)含己糖醛酸的结缔组织黏液物质。(2)含唾液酸的上皮性黏液物质:又称为上皮性唾液酸黏液。糖类

四、黏蛋白黏蛋白(mucoproteins)为多糖与蛋白质结合的复合物,含氨基己糖超过4%。黏蛋白见于上皮的基膜、结肠和支气管上皮的杯状细胞等,黏蛋白PAS反应呈阳性。如PAS反应阳性,再行蛋白质染色也呈阳性,则可认为是黏蛋白。糖类

五、糖蛋白糖蛋白(glycoproteins)为多糖与蛋白质结合的复合物,含氨基己糖少于4%。糖蛋白见于垂体的嗜碱性细胞、甲状腺滤泡腔内的胶质、胶原纤维和网状纤维、血清蛋白和球蛋白等,PAS反应阳性。糖类

六、糖脂糖脂（glycolipids）为多糖与脂类结合的复合物,含有半乳糖、脂肪酸和神经氨基醇,属此类的有脑苷脂和神经节苷脂,存在于中枢神经系统及周围神经组织。PAS反应阳性,冷冻切片脂类染色阳性。糖类

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糖类糖原糖类

糖原

糖原(glycogen)是单纯的多糖,存在于动物体内,因其功能和结构与植物淀粉相似,故又称为动物淀粉。它是由葡萄糖组成的,带分支的大分子多糖。糖原主要在肝脏合成,在肝内糖原作为能量的暂时储备,在骨骼肌主要作为供给肌肉活动的能量。在正常情况下,糖原位于胞质内。组织内的糖原可分为不稳定性和稳定性糖原。不稳定性糖原在正情况下储积于肝脏和肌肉,这种糖原根据身体能量的需要很容易转化为葡萄糖,稳定性糖原仅以微量存积于身体的各种组织和细胞内,如神经细胞、子宫颈和阴道上皮细胞、软骨细胞以及中性粒细胞等糖原糖原易溶于水,一般应免用水溶性的固定液进行固定。糖原并不是与蛋白质发生化学结合,而是机械的包含在凝结的蛋白质内。所以,组织经甲醛液固定后细胞内的糖原(特别是稳定性糖原）仍可溶于水,因而应采用含乙解的溶液作为固定液，但稳定性糖原经甲醛固定后仍可大部分保留。常用于固定糖原的固定液有乙醇、Gendre液、Carnoy液等,这些固定液能较好地保存糖原；但却有使糖原流动到细胞一侧的现象,这现象称为“极化现象”。较理想的是用不经固定的低温恒冷切片技术,这样可显示出糖原在细胞质内的原有分布。显示糖原的方法有高碘酸无色品红法(PAS)、Bauer铬酸无色品红法、Best脂红法和高碘酸-六胺银法等。应用淀粉酶或唾液于染色前进行消化即可证实,即在对照片经消化后行PAS染色为阴性的可认为是糖原。高碘酸-无色品红法操作简使;Best胭脂红法显示的糖原为鲜红色,能长期保存而不褪色,但技术性较高；高碘酸-六胺银法虽能显示糖原,但其他物质也被显示出来，五特异性。(一)试剂配制1.0.5%的高碘酸2.1mol/L盐酸3.无色品红液4.0.5%的偏重亚硫酸钠5.Mayer苏木精液6.1%的淀粉酶或唾液7.唾液糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(二)染色步骤1.新鲜薄片组织,立即用Gendre液固定3~6小时或Camoy液固定1~3小时,然后转入95%的乙醇,期间可更换1~2次95%的乙醇。2.第二天上午转入无水乙醇按常规脱水透明浸蜡,石蜡包埋,切片厚4μm。3.取两张连续切片,分别作A和B记号,然后把B片脱蜡至水(在水中仅稍水洗)。4.把B号切片浸入预热至37℃1%的淀粉酶,于37℃的恒温箱内消化1小时,或用预热至37℃的唾液于37℃的温箱消化30分钟。5.取出切片稍水洗。6.在B片消化过程中,把A片脱蜡至水。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(二)染色步骤7.在A和B两片同时滴入0.5%的高碘酸氧化5~8分钟。8.流水冲洗2分钟,再用蒸馏水浸洗2次。9.切片浸入无色品红液(加盖)于暗处作用15~20分钟。10.0.5%的偏重亚硫酸钠滴洗2次,每次2分钟。11.流水冲洗5分钟。12.Mayer苏木精浅染胞核约3分钟。13.流水冲洗10分钟。14.常规脱水透明,中性树胶封固。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(三)结果未经消化的A片胞质内阳性的红紫色颗粒为糖原,经消化后的B片应为阴性,胞核呈蓝色。如不作消化对照,组织上出现PAS阳性物质主要有糖原、甲状腺滤泡胶质、消化道、呼吸道和唾液腺的上皮黏液、垂体的嗜碱性细胞、软骨基质、真菌、上皮的基膜、纤维蛋白、胶原纤维、中枢神经系统均呈红紫色。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）图PAS法肝组织，糖原呈红紫色

(四)注意事项1.高碘酸和偏重亚硫酸钠液应用小口砂塞瓶盛装塞紧密封置冰箱保存,可使用数月。用高碘酸氧化,比其他氧化剂优越,因为它不会把所形成的醛基进一步氧化2.碱性品红有不同的厂牌和批号,有些纯度较高,可以少加活性炭。若配好的无色品红液仍呈微淡红色时,可再加入一些活性炭摇匀后过滤,这就使溶液无色,这样的碱性品红仍可使用。3.偏重亚硫酸钠或钾盐均可使用,但质量一定要纯,要有较浓的刺激性气味,否则作用效果不好就配制不成功。偏重亚硫酸钠用后一定要密封好。4.在配制过程中所用的玻璃器皿要求十分干净,一般要用硫酸洗液浸洗过。5.不要在蒸馏水沸腾时加入碱性品红,应在停止加热取出蒸馏水待1分钟后才加入，否则沸腾的水蒸气会把碱性品红液喷溅出来。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(四)注意事项6.无色品红液要放冰箱保存,临用前半小时取出恢复至室温,用后又倒回原瓶内放冰箱保存。如此可反复使用多次,至溶液出现淡红色时才倾弃不用。7.切片在无色品红液作用的时间随室温而定,夏季若室温高,作用10分钟已足够,冬季室温低,可延长至20分钟左右。8.本法如用Harris苏木精染胞核,则必须经盐酸乙醇分化,否则糖原带紫蓝色而不鲜艳。9.用Gendre液固定的组织,糖原呈粗颗粒状。Carnoy液固定的组织,糖原呈细颗粒状。10.淀粉酶如存放过久,很易失效。因此,新买回来的淀粉酶要经过试验(消化已知含糖原的切片)才能使用。唾液的消化作用很强,操作虽然麻烦一些,但效果较好。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(五)染色机制碱性品红液经亚硫酸作用生成无色品红液(又称Schiff试剂)。高碘酸是一种氧化剂，它能破坏多糖类结构的碳键。组织切片首先用高碘酸氧化,使存在于组织内多糖分子的两个相邻带有羟基的一C—C—一键打开,生成二醛。其后,暴露出来的游离醛基与无色品红液作用,生成新的红紫色复合物而显示出来。糖原（高碘酸-无色品红法(PAS法)(根据McManus)）(一)试剂配制1.Harris苏木精液2.Best胭脂红贮备液3.Best朋脂红工作液4.Best分化液20ml糖原（胭脂红法(根据Best)）(二)染色步骤1.新鲜薄片组织立即固定于Gendre液或Camoy液中。2.切片脱蜡至水.3.Harris苏木精液染5~10分钟。4.稍水洗。5.1%的盐酸乙醇稍分化。6.流水冲洗10钟。7.浸入Best胭脂红工作液(加盖)染20~30分钟。8.不用水洗,直接用Best分化液浸洗2次(把切片提高又放下),每次1~3秒。9.95%的乙醇浸洗,再用无水乙醇脱水3次。10.二甲苯透明,中性树胶封固。糖原（胭脂红法(根据Best)）(三)结果糖原颗粒呈鲜红色,胞核呈蓝色。(四)注意事项1.如需作消化对照,可按上法的步骤进行。2.在用水浴煮沸胭脂红储备液时,应出现较强烈的泡沫,否则应该是所用的药物不够纯。3.配制胭脂红贮备液和胭脂红工作液的氢氧化铵要有足够浓度,染片时要用密盖的高身染色盅盛装染液。4.染色时切片从Best胭脂红工作液取出后,应立即用Best分化液分化。不要让切片干燥,更不能水洗。5.Best胭脂红贮备液必须密塞装载存于冰箱,一般可保存3~6个月。Best胭脂红工作液仅限于临用前配制,用后即倾去。6.染Harris苏木精后,必须用1%盐酸乙醇分化,否则所显示的糖原呈暗红紫色而不够鲜艳。糖原（胭脂红法(根据Best)）(五)染色机制Best胭脂红法是一种古典的糖原染色法,技术操作要求高,有时较难掌握。其染色机制仍不够了解,有学者认为可能是糖原分子内的羟基和胭脂红染液内的氢原子之间生成氢键形成复合物而显色。氢氧化铵在染液中的作用是将染液的pH提高至10~11,pH低于10则失去染色的选择性。糖原（胭脂红法(根据Best)）(六)应用在常规石蜡切片的HE染色,如胞质内见有大小不一的空泡出现,这可能是脂滴在经脂溶剂的脱水透明过程中溶解而成,也可能是糖原在经水溶液固定剂固定过程中脱失所致,在这种情况下可做糖原染色加以证明。糖原染色用以观察肝组织在某些病变时糖原的分布状况和量的增减情况。如饥饿时肝细胞内肝糖原减少,在糖尿病时,肝细胞胞质内出现大量糖原(也可见于胞核内,称为核糖原)。糖原（胭脂红法(根据Best)）