药基基因工程课件

基因工程技术(Geneticengineering)12.基因工程（geneticengineering）：在分子水平上用人工方法提取或制备DNA，在体外切割，与载体连接成重组体，然后采用一定方法把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要表达不同的蛋白产物或定向的创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给子代。一、基本概念1.基因（gene）：是生物体传递遗传信息和表达遗传信息的基本单位。目前认为它是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部核苷酸序列。2

分：目的基因的获取、载体的选择切：限制性内切酶的应用接：用连接酶将目的基因和载体连接重组体转：将重组体导入到受体细胞筛：采用适当的方筛选出含有目的基因的阳性克隆表：目的基因在受体细胞表达，获取表达产物二、基因工程的基本程序：

分、切、接、转、筛、表3GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAG分切接转筛表4三、基因工程实验特点及要求1.微量操作

2.连续性操作

3.低温操作

4.防止污染（杂质污染、细菌污染）5.实验物品切忌乱扔乱丢

6.认真写好实验纪录5第一次实验:质粒DNA大量制备、浓度分析第二次实验：DNA限制性内切酶消化、电泳、片段回收、重组连接第三次实验：重组质粒的转化、PCR

第四次实验：重组质粒的鉴定（质粒DNA小量快速制备）、杂交第五次实验：显色、考试6实验一

质粒DNA大量制备、浓度及纯度分析目的：获得高浓度、高纯度的质粒DNA。为酶切和基因转染作准备。质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的环状双链DNA,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。

78载体的选择标准能自主复制；具有遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。910基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增:

将表达质粒DNA的活细菌进行大量培养。细菌的采集和裂解,抽提质粒DNA：碱变性法提质粒；质粒DNA的提纯:除蛋白质、RNA和与质粒DNA分子量相近的断裂染色体DNA。11碱变性抽提质粒DNA原理：利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同，变性和复性的差异。在pH=12.6的NaOH-SDS环境下，质粒DNA与染色体DNA的氢键均破坏，但是染色体DNA断裂成线状，而质粒DNA仍为闭环，且相互缠绕没有分开。当pH调整到7.0，质粒DNA复性存在溶液中，而染色体DNA不能复性与变性的蛋白质、SDS相互缠绕形成沉淀，经离心被分离。12质粒DNA的纯化：蛋白质的清除：蛋白质的变性剂——酚和氯仿.RNA的清除：RNA酶消化；LiCl沉淀;层析。与质粒分子量相近的线状断裂的染色体DNA的清除：等体积1.6mol/LNaCl,13%PEG;CsCl梯度超速离心等。13CsCl密度梯度超速离心法：CsCl是一种高分子量的重金属盐，在较长时间超速离心后，形成浓度梯度，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡时，染色体DNA、质粒、RNA等各分离颗粒，在密度梯度中沉降或漂浮。他们在密度梯度中的位置分布不依据沉降速率、分子大小及离心时间，而是取决于密度。EB是一种丫啶类染料，可嵌入双链DNA的碱基之间，使DNA的解旋体积增大，浮力密度变小。EB与环状质粒DNA的结合量小于线状染色体DNA的结合量，故质粒DNA的浮力密度大与线状染色体DNA,位于离心管的下层。RNA总是与Cs+结合，密度最大，超离时位于管底。

14Sepharose2B柱层析法（琼脂糖凝胶柱）利用分子筛效应，分子量大的分子不能进入凝胶颗粒网孔，顺着颗粒间隙先流出，分子量小的分子进入凝胶颗粒孔经内，流程长，后流出来。质粒DNA分子量大于RNA，故先洗脱下来。15LiCl沉淀法：Li+可与RNA结合，形成锂盐沉淀，而DNA不与锂结合，故经离心可将二者分离。注意在变性阶段，操作要温柔，不要使染色体DNA断裂。聚乙二醇沉淀法：只沉淀环状DNA16操作步骤:收集细菌GET悬浮SDS-NaOHpH=12.6碱变性KAcpH=4.8质粒DNA完全复性染色体DNA不能复性离心上清:质粒,小分子RNA,少量蛋白质沉淀:染色体DNA,大分子RNA,SDS-蛋白质复合物取上清,加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积)离心沉淀溶于TE等体积LiCl17沉淀RNA离心加等体积酚氯仿异戊醇去杂蛋白离心,取上层水相酚氯仿异戊醇重复一次离心,取上层水相2倍体积无水乙醇0.1体积NaAc沉淀DNA离心70%乙醇清洗沉淀晾干TE(50ul)溶解沉淀取5ul电泳鉴定取上清,加等体积异丙醇沉淀DNA(缩小体积)离心沉淀溶于500ulTE，RNA酶消化30min18

DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离原理以琼脂糖为电泳支持物，DNA因分子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。DNA可与荧光染料——溴化乙锭（EB）结合，在紫外灯照射下呈桔红色荧光条带。DNA可与荧光染料——Goldview结合，在紫外灯照射下呈绿色荧光条带。。琼脂糖凝胶电泳的优点：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理；琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98-99％），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；凝胶透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用字外监测及定量测定；区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定，制成干膜可长期保存。19DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素：1.核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反比，但当>20kb时，迁移率不在依赖于分子大小；2.核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环DNA>直线DNA>开环环状DNA3.与凝胶浓度关系:一定大小的DNA在不同凝胶浓度中迁移率不同；4.其它影响因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（<5v/cm）等20DNA浓度及纯度分析:紫外分光光度法双链DNA:1OD260nm=50ug/ml单链DNA或RNA:1OD260nm=40ug/ml核苷酸:1OD260nm=20ug/mlRNA:OD260nmOD280nm>2.0DNA:OD260nmOD280nm=1.7<2.0,蛋白质污染>1.7,RNA污染<1.7,蛋白质污染21结果分析：线状DNA超螺旋DNA22第二次试验：构建重组DNA载体的酶切消化酶切产物琼脂糖凝胶电泳DNA片段回收目的基因、载体重组连接23一、质粒DNA的限制性内切酶消化酶解原理限制性内切酶（restrictionenzyme）是细菌体内含有的一类能特异识别双链DNA分子的特定序列，并对其进行切割的核酸内切酶。共有三类，其中二类因其有固定的切割位点，只有酶限制性无修饰性，不需要ATP，实用性大，是基因工程常用工具酶之一。作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。其识别序列特点及酶切产物：4-6bp，回文结构；粘性末端或平端24BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口25命名方式（以HindIII为例）：

属：H—Haemaphilus种：in—influenza株：d—ｄ株编号：Ⅲ26同功异源酶

来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ27同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡ

GGATCCCCTAGG

AGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA28限制性内切酶（ＲＥ）单位及实际用量：

在限定的温度和反应环境中，１小时消化1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用3-5u/ugDNA，延长３小时以上，是酶切反应更彻底。RE保存条件：50%甘油中，用时需稀释10倍以上才能解除抑制。29酶切系统组成及计算方法：根据DNA量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。质粒DNA

10ug(10ul)1ug/ul10buffer1.5-2.5ulRE30-50U(1.5-2.5ul)20U/uld3H2O6ul———————————————————————总体积15-25ul

加样顺序：先加水，再加buffer和DNA，最后加酶30操作步骤：质粒DNA

20ul(10ug)10buffer3ulXbal1.5ul(30U)HindIII1.5ul(30U)d3H2O4ul————————————————————总体积30ul加样，短暂离心，370C水浴消化。31三、DNA片段回收及纯化DEAE－纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条DEAE－纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA洗脱下来。此方法简单，可同时用于许多片段，且获得的DNA极纯，但仅适用于小片段DNA（<5Kb），>15Kb的DNA片段和单链DNA不适合，因难以洗脱下来。32三、DNA片段回收及纯化透析袋电洗脱法：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE电泳槽中，电泳2-3小时，使DNA从凝胶中电洗脱下来。此法可以回收大小范围较宽的DNA，但很不方便。从低溶点琼脂糖凝胶中回收DNA：琼脂糖的糖链上引入了羟乙基，在300C左右成胶，大约在650C熔化，在大多数双链DNA熔点温度以下。采用挖槽法酚冻法。33纯化：1.DEAE－Sephacel柱层析法：将带负电荷的DNA结合到一种阳离子基质上而将污染物洗脱下来，在提高缓冲液的离子强度将DNA洗脱下来。2.有机溶剂抽提法：用2-丁醇和酚－氯仿抽提。34制胶点样电泳分离回收片段抽提沉淀DNA。操作步骤:35结果分析：分子量标准：λ噬菌体的DNA，全长49.01kb，经HindⅢ消化产生7条带，23.7kb,9.46kb,6.75kb,4.26kb,2.26kb,1.98kb,0.58kb完全酶解的质粒有两条带及目的基因和载体，分别为1.1kb和5.4kb，应位于1.98和0.58kb及4.26-6.75kb之间溴酚蓝前的绿色带为RNA若酶解未完全可能出现超螺旋、线性、开环三种构象。36－＋开环线性超螺旋37

markerplasmidREdigested38四、DNA片段的重组连接原理

1.在T4DNA连接酶的催化下，载体基因片段与目的基因片段的粘性末端共价结合,连接,环化成重组环状DNA分子。392.连接方式：粘接、平接、尾接、人工接头器3.影响重组连接因素:目的基因的浓度与载体的比例(3-5:1)；离子浓度；温度：14-160C。4.DNA连接酶单位：用Weiss单位对酶进行标化：1个Weiss单位指在370C下20分钟内催化1nmol32Pi从焦磷酸根置换到[γ,β-32Pi]ATP所需的酶量。40（三）外源基因与载体的连接1.粘性末端连接

方式：(1)同一限制酶切位点连接

(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接41BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接42不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。432.平端连接

适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端44目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连453.同聚物加尾连接

在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。465´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´

3´5´

5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´3´

3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体474.人工接头(linker)连接：

由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

48人工接头及其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ49连接体系目的基因：8ul载体质粒2ul10xBuffer1.5ulT4DNA连接酶1ul水2.5ul总体积：15ul50第三次实验感受态细菌的制备及转化实验原理1.将重组DNA分子导入受体细菌中进行复制扩增，再进行检测，以获得正确的阳性重组体。将重组DNA导入受体细胞的过程中叫做转化或转染。一般受体细菌对重组DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。后来人们发现，用氯化钙处理后的细菌细胞对DNA的摄取能力大为增加，转化效率提高。这种细菌细胞能摄取外来DNA的生理状态称为感受态，此阶段的细菌称感受态细菌。512.感受态形成假说：局部原生质体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，局部的细胞壁被破坏，形成一些小孔，允许外来DNA分子进入。酶-受体假说：用特定的化学或物理因素处理细胞后，细胞壁是完整的，但在壁上产生了一些酶的位点，可以把外来DNA转入胞内。523.制备方法：电击法:将细菌置入一定的容器内，通入高脉冲电压，使细菌处于感受态，此法成功效率高，可达1010/1ugDNA，但细胞容易死亡，约一半以上的细胞死亡。化学法：如：Ca2+、DMSO、还原剂、氯化六氨合高钴等，成功率可达105-8/ugDNA。534.受体菌的改造与选择：限制与修饰系统：R-,M-或R-,M+的突变体，（R：restriction;M:modification）重组系统：选用rec+的转化（提高转化效率），再转到rec-受体菌中保存（防治整合到染色体DNA基因组中去）。有明显的选择性差异：例如，载体Ampr,目的基因Strr，应选择Amps/Strs的受体菌。空菌选择能够发展成为感受态细胞的菌株做受体菌：肺炎双球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母系统。54转化时期选择：细菌生长时相分为：静止期、对数生长期、稳定期和衰亡期。转化最佳时期应选择在对数生长期的后期。OD550nm=0.2-0.3（5-6108细胞/ml）555.转化：外来DNA进入细菌内部的过程。具体过程：a.吸附：dsDNA吸附在细菌表面；b.转入：一条ssDNA进入细胞并被蛋白质保护起来，另一条降解；c.自稳：ssDNAdsDNA；d.复制表达*在革兰氏阴性菌中，产生感受态因子，并将dsDNA吸附到胞壁上；在革兰式阳性菌中，因没有分离到感受态因子，DNA以双链进入。现选用一种常用制备感受态细菌的方法（CaCl2），供实验应用。细菌在低渗的CaCl2溶液中逐渐膨胀成球形，DNA与Ca2+形成羟基－钙－磷酸复合物，被吸附在细菌表面，细菌经短暂热休克刺激被细菌摄取。56操作步骤：（见讲义，穿插PCR、southern转膜）注意事项：1.冰浴操作，增加感受态量及延长感受态时间。

2.无菌操作，防止杂菌污染。

3.试剂要求纯度高

4.重组时的高盐，在转化时要稀释

5.涂皿时不要来回涂布57预期结果及结果分析：1.正常结果：空白对照不长菌，阳性对照和重组组长菌。2.所有的皿都不长菌：转化系统有问题。3.都长菌：试剂或操作过程中被污染。4.连接不成功。58PCR。

PCR(polymerasechainreaction)——聚合酶链反应，其原理是依据细胞中DNA半保留复制机理，DNA在不同温度下变性、复性的特性，人为控制温度——高温变性、低温复性、适温延伸，循环多次后，可使目的基因得到扩增。以待扩增的DNA分子为模板，以一对分别于模板5末端和3末端互补配对的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸至完成新的DNA合成，重复这一过程（变性、退火、延伸），即可使目的DNA片段得到扩增。595引物A5引物B第二次循环第一次循环55

55

5

5模板DNA5

5

5555

5

5一、基本工作原理60

25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第三次循环5

5

5555

5

555

5

555

5

561PCR反应体系的基本成分：模板DNA（ng，无严格要求）；特异性引物（通常0.1-0.5umol/L）；DNA聚合酶（2.5-5U）；dNTP(20-200umol/L)；含Mg2+的缓冲液（Mg2+1.5mmol/L,Tris-HClpH8.3-8.8,KCl50mmol/L,明胶0.1%,甲酰胺5%）PCR的基本反应步骤：变性，退火、延伸，可循环25-30次，扩增效率为P=A*(1+X)n62三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C63主要用途：目的基因克隆；基因的体外突变；DNA的微量分析PCR的特点：高度的敏感性；高度的特异性；操作简便，快速；广泛的适用性PCR在医学中的应用：遗传性疾病的基因诊断；病原体的检测；癌基因与抑癌基因的检测；在法医学上的应用。PCR引物设计原则：引物长度15-30bp；GC含量40%-55%；Tm高于550C；引物与模板非特异性配对的配对率<70%;引物之间配对的碱基数<3；引物自身配对<3；引物3末端碱基原则上要求与模板一定要配对，最好选T，C，G，而不选A。64PCR按表加样10*buffer 5uldNTP（200umol/L）1ul引物（10-100pmol）2ul模板（0.1-2ug）10ulTaq酶（2.5-5U）2ulMgCl21.5mmol/L）2ulH2O28ul总体积50ul循环条件940C5min25cycle720C10min940C45sec540C45sec720C45sec65第四次实验质粒DNA的小量快速提取制备目的：为了证实所得的转化子的重组质粒DNA是否确实由载体质粒与目的基因组成，已排除其它可能方式的连接。常用鉴定方法：小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析；互补；插入失活；杂交筛选。正常重组DNA：经酶切电泳，可获得5.4kb的载体和1.1kb的目的基因。错误基因插入：不能酶切或片段大小不同。反向连接（出现在平端连接）：不被酶切或片段大小不同。载体自我环化：没有小片段。6667（五）重组体的筛选

1.直接选择法：

(1)

抗药性标记选择

(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交

Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等68(插入失活法)抗药性标记选择69组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成λDNA重组体标志补救70α互补71

α互补的检测72原位杂交73Southern印迹74鸡的β肌球蛋白的克隆和检出75杂交用来鉴定DNA中某一特定的基因片段。原理：根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能专一配对的原理进行。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交成双链核酸分子，通常利用以标记的某一DNA（或RNA）片段作为探针，探测核酸分子中是否有与探针同源的序列。76①②③Southern印迹杂交77放射自显影照片78实验步骤包括:提取细胞内的染色体DNA，酶切电泳。凝胶上的DNA碱变性处理:因为大片段的DNA

(>15kb)转移不完全,转移效率取决于在其脱水前离开凝胶的分子所占比例。先经弱酸作用引起部分脱嘌呤作用，然后用强碱处理水解脱嘌呤部位的磷酸二酯键，产生的DNA片段可高效率转移,双链变成单链.Southern转移：毛细管转移(转移的速率取决于DNA片断的大小和凝胶中琼脂糖的浓度）；电转移；真空转移。制备探针：DNA的切口平移（利用DNA聚合酶具有3’5’聚合活性和5’3’外切酶活性进行标记）；随机引物合成预杂交，杂交及杂交信号检测79Dotblot(斑点杂交）DNA转移固化探针标记杂交免疫检测80一、DNA转移固化待检测DNA的分离纯化DNA变性：