6第六章-外源化学物的一般毒性作用解读课件

外源化学物的一般毒性作用

(commontoxicityofchemicalpoison)青大医学院公共卫生系王树林7/23/20231第六章外源化学物的一般毒性作用第一节概述第二节急性毒性作用第三节局部毒性作用第四节短期、亚慢性和慢性毒性实验7/23/20232第一节概述毒理学研究方法体外实验(invitro)流行病学研究

(EpidemiologicalStudy)

体内实验(invivo)

整体动物实验人体观察

离体器官组织：

心、肝、肺、肾、脑细胞原代细胞、细胞株、细胞系细胞器：线粒体、微粒体等特殊毒性：致突变致畸致癌

临床毒理学研究：中毒事故的处理或治疗描述流行病学研究：提出病因假说分析流行病学研究：

验证病因假说，明确因果关系基础毒性：急性亚急性亚慢性慢性刺激性志愿者研究：低浓度、短时间、可逆性7/23/20233第一节概述毒理学研究方法分类：一、按染毒频率分为：急性毒性实验：24小时内一次或多次染毒蓄积毒性实验：多次重复染毒二、按染毒时间分为：急性毒性实验：24小时内一次或多次染毒亚急性毒性实验：1~30天重复染毒（短期重复染毒实验）亚慢性毒性实验：1~3个月重复染毒慢性毒性实验：3个月以上重复染毒7/23/20234第一节概述三、按整个实验时间分为：短期毒性实验：实验数天至数周内完成，如：诱变实验中期毒性实验：实验数周至数月内完成，如：特定靶器官的致癌实验长期毒性实验（终生毒性实验）：数月至终生致癌实验多代毒性实验：实验须经历一代、二代或三代。如：繁殖实验7/23/20235第一节概述我国对农药、食品污染物、化妆品和消毒剂等化学物毒性试验期限实验农药食品污染物化妆品消毒剂亚急性1-4周短期亚慢性3-6周90天至少90天90天慢性大鼠18月同左至少6月6月-2年小鼠24月同左7/23/20236一般毒性实验方法要点根据外源化学物种类的不同，急性毒性试验的程序和要求有所不同。但总体原则和要点是相似的。主要包括：7/23/20237一般毒性实验方法要点实验动物：选择（种属、品系、清洁级别）性别、年龄、体重数量、分组饲养环境环境适应与检疫禁食受试物：化学结构和理化性质环节质控：批次、保管、分样、称重、配制剂型：水溶液、混悬液、油溶液（溶剂和助剂）材料7/23/20238一般毒性实验方法要点染毒方法染毒剂量效应观察观察时间和周期观察指标整体一般观察中毒体征及发生过程（发生时间）死亡情况及时间分布体重变化取材病理检查生化检验方法7/23/20239一般毒性实验方法要点结果统计和描述中毒体征和时间关系死亡情况与时间关系剂量（反应）效应关系生化检验结果的统计病理检查结果的描述分析讨论和评定分析讨论实验结果形成的原因分析讨论实验结果所揭示的问题对实验的评定对毒物的评定讨论结果7/23/202310一、实验动物

（1、选择原则）实验动物的选择原则：尽量选择急性毒性反应与人近似的动物（种属）品系（如SD、Wistar大鼠等）纯化、适宜清洁级别（影响因素易控）易于饲养，试验动物操作方便

繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应

价格较低，易于获得动物常用实验动物为大白鼠和小白鼠7/23/202311一、实验动物

（2、性别、年龄、体重）性别动物应当是雌、雄各半

如果在研究中发现待测化学物对雌、雄动物的毒性大小有明显差异时，应分别求出雌性与雄性动物各自的LD50值如果试验是为致畸试验作剂量准备，也可仅做雌性动物的LD50试验7/23/202312年龄急性毒性试验选用的实验动物年龄通常要求初成年的动物，且为健康未交配和受孕的动物；亚慢性要求性刚成熟，慢性要求初断乳。体重同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。一、实验动物

（2、性别、年龄、体重）7/23/202313动物种类生活年限(年)成年体重选择范围(g)时间(月)体重(g)急性实验慢性实验小鼠1.5~221518~2510~15大鼠2~2.53150150~25050~100豚鼠6~83250200~250150~200兔4~93~415001500~20001200~1500猫10~123~415001500~25001000~1500狗15~203~4100008000~15000400~8000实验动物的生活年限及体重选择一、实验动物

（2、性别、年龄、体重）7/23/202314一、实验动物

（3、数量、分组）数量在利用不同的方法测定化学物LD50时，实验设计中对动物数的要求不同霍恩氏法测LD50时要求有4个剂量组，每组4或5只动物概率单位法、Bliss法测定则要求5—7个剂量组，每组10只动物或10只以上对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量7/23/202315一、实验动物

（3、数量、分组）分组：均衡性和随机性均衡性：要求各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致。具体来说是（1）实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20％---控制离散度（2）每组之间的平均体重相差不应超过10％---控制均衡性随机性：每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见或系统误差7/23/202316一、实验动物

（4、饲养环境）实验动物的饲养环境（无特殊环境要求时）应具有适宜性、清洁性、恒定性。小气候：温度(22±3℃)、湿度(30~70%)、通风、照明(昼夜各半)等。笼具垫料饮水饲料7/23/202317一、实验动物

（5、环境适应与检疫）在选择和购买实验动物后，应先进行动物的染毒前环境适应和检疫观察。环境适应：让外购来的实验动物在本试验室条件下适应一段时间，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响；筛检健康、体重等不符合试验要求的动物。在检疫期内出现临床异常者应予放弃，不可用于试验。检疫期内雌雄必须注意分笼饲养，防止交配和受孕。大鼠、小鼠、豚鼠、兔的检疫期为1周，犬、猴等适当地延长至2~3周。7/23/202318一、实验动物

（6、禁食）禁食采用经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰，因此在试验给药前应作禁食处理。禁食时间：大鼠主要在夜间进食，所以要求染毒前应隔夜禁食。小鼠和大鼠基本类似，但由于其消化吸收和代谢速度较快，可隔夜禁食也可禁食4小时以上。大动物常在上午染毒，前一天正常给食，染毒前不喂食即可。禁食期间均正常给予饮水。染毒2小时后提供饲料。经口多次染毒，可不禁食。7/23/202319二、受试物处理受试物时应了解：受试物的纯度及杂质成分；化学结构理化性质：挥发性（熔点/沸点）、溶解性、PH、稳定性。化学结构和理化性质相似化合物的毒性资料。7/23/202320二、受试物受试物要求：分析纯同一种、同一批号成分和配方固定（如为异构体混合物，异构体比例必须固定）一次备齐所需受试物总量=(A×B×C×D)×1.2A为每组动物数；B为各处理组的剂量和；C为染毒次数（通常为天）；D为动物的平均体重；1.2为安全因子，包含损耗量。7/23/202321二、受试物处理受试物时每个环节都应质控批次运输保管分样称重配制贮存7/23/202322二、受试物常用剂型：水溶液、油溶液和混悬液。处理受试物时，所选溶剂或助剂的要求是：无毒、无特殊刺激性和气味；不与受试物发生反应，受试物在溶剂或助剂中稳定；不影响受试物的毒性（毒动学和毒效学）；受试物在溶剂或助剂中稳定。7/23/202323三、染毒途径一般毒性试验染毒途径(exposureroutes)的选择应考虑几方面因素：模拟人在生活和生产环境中实际接触该受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。7/23/202324三、染毒途径

（1、经口染毒）经口（胃肠道）染毒(oralexposure)经口途径：可分为灌胃、喂饲、吞咽胶囊等方式。经口灌胃染毒是急性毒性试验中最常用的染毒途径。一般来说新的化学物均先进行经口染毒途径的急性毒性试验，求出LD50值。通常以经口途径的LD50值来比较不同化学物急性毒性大小。7/23/202325三、染毒途径

（1、经口染毒）灌胃：空腹灌胃后2-3h复食灌胃的体积不超过体重的1-2％：小鼠为0.2~1.0ml/只或0.1~0.5ml/10g较合适；大鼠为5ml/只(通常用0.5~1.0ml/100g）；家兔为10ml/2kg体重；狗不超过50ml/10kg7/23/202326三、染毒途径

（2、经呼吸道)经呼吸道染毒在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入吸入接触分为两种方式静式吸入动式吸入7/23/202327三、染毒途径

（3、经皮肤）经皮肤染毒研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50)所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。7/23/202328三、染毒途径

（3、经皮肤）经皮肤染毒程序给予受试物前24h，确定受试部位机械或化学脱毛面积10%～15%体表面积检查去毛部位有无异常现象单位体重相同容积染毒接触时间与人实际接触该化学物的时间相仿7/23/202329三、染毒途径

（4、注射）注射途径可分为静脉注射或滴注、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、椎管内注射等。使用注射途径染毒时需注意控制注射量、注射速度。应调整受试物的pH及渗透压，pH一般应为5~8，用等渗溶液。毒物代谢动力学研究，注射药品毒性7/23/202330三、染毒途径

（4、注射）注射方式小鼠大鼠豚鼠兔狗腹腔0.2~1.01~32~55~105~15肌肉0.1~0.20.2~0.50.2~0.50.5~12~5静脉0.2~0.51~21~53~105~15皮下0.1~0.50.5~10.5~21~33~10常用实验动物给于受试物的体积（ml）7/23/202331四、染毒剂量染毒剂量的确定剂量选择是一般毒性试验成功的基础。首先了解分析受试化学物的化学结构和其理化性质，查阅文献，找出毒性资料，并以前期研究得到的毒性参数为基础设计。做预试验。每个剂量组间的组距可以大些，有利于找出受试化学物的致死剂量范围。7/23/202332五、效应观察

（1、观察时间和周期）观察时间和周期测定外源化学物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化学物之后两周（14天）内的总死亡数对于一些速死性化学物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率有些速死性化学物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础7/23/202333五、效应观察

（2、整体毒效应观察）中毒体征及发生过程（发生时间）实验动物的毒性表现有一些规律，许多毒物染毒后，往往出现：兴奋→抑制→死亡。含有氰基（－CN）的氢氰酸和丙烯腈对大鼠和小鼠染毒抑制→死亡。N–苯甲酰基-（3，4–二氯苯基）-2–氨基–丙酸乙酯，一般性的中毒表现，很快恢复，数日内均“安然无恙”，近一周后才逐渐表现为抑制、拒食、消瘦、衰弱，昏迷直至死亡。二磷酸盐类药物7/23/202334五、效应观察

（2、整体毒效应观察）死亡情况及时间分布：计算LD50

体重变化：有助于了解受试化学物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应体重可以反映动物中毒后的整体变化体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。7/23/202335五、效应观察

（3、病理检查和生化检验）病理检查凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查对存活动物于观察期结束后应做病理学检查生化检验7/23/202336五、效应观察

（4、标本检测原则）1、首先估算每只动物检测样本的量（如，采血量、肝脏、脾脏、肾脏重量）2、估算各检测项目需检测标本的量，是否能满足全部设计的检测项目。3、首先应满足接触标志物和效应标志物，其次能反映靶标和有助于机制探索的检测项目。7/23/202337第二节急性毒性作用

(acutetoxicitytest)急性毒性概念急性实验目的急性毒性实验方法要点急性毒性分级和评价7/23/202338概述—急性毒性实验（一）急性毒性概念

急性毒性(acutetoxicity)：是指机体(人或实验动物)一次或24小时内多次接触外源化学物后在短期内(一般到14天)所产生的毒性效应。包括一般行为、外观改变、大体改变及死亡效应，最主要观察指标是LD50。7/23/202339概述—急性毒性实验（二）注意事项（1.染毒次数与时间）实验动物接触化学物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同：经口和注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程所以“一次”含有时间因素7/23/202340概述—急性毒性实验（二）注意事项（1.染毒次数与时间）“24小时多次”的概念是指当外源化学物毒性很低，一次最大染毒给予实验动物后还不能达到充分了解该毒物急性毒性作用的目的，从而在24小时内分次染毒，即为“多次”。国内一般规定为24小时内不超过3次。7/23/202341概述—急性毒性实验（二）注意事项（2.毒效应出现时间）不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间来判定该毒物的某种毒性效应是否属于急性毒性，因为：有的化学毒物在实验动物接触数分钟内即可产生严重中毒症状，甚至瞬间死亡；而有些化学毒物几天、十几天后动物才产生明显的中毒症状和死亡，呈现迟发毒效应和死亡。有的化学毒物在出现快速和剧烈的毒效应后很快恢复；有的化学物早期仅有较轻微症状，很快恢复，但在几天后又出现严重中毒症状甚至死亡。7/23/202342概述—急性毒性实验（二）注意事项（2.毒效应出现时间）一般急性大剂量染毒可引起速发毒性也能引起迟发毒性，可能产生也可能不产生与重复染毒类似的毒性。应主要以接触毒物的时间，规定的“一次或24小时内多次接触”后所产生的毒性效应。观察急性毒效应一般为14天，如有必要可延长至14天以上。7/23/202343概述—急性毒性实验（二）注意事项（3.毒效应强度）急性毒性与亚慢性、慢性中毒相比其症状常常是很剧烈的，机体急性一次性大剂量接触毒物后所表现出的一般行为，外观、大体形态的改变十分明显，中毒症状严重，常常发生死亡。急性毒性常常以死亡为观察重点和观察终点。7/23/202344概述—急性毒性实验各个剂量组的确定急性毒性试验除设立几个剂量组外，是否设正常和溶剂对照组，有不同意见。但在实际工作中，除有特殊规定外，均不设立对照组。剂量组数需根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定。如寇氏法、Bliss法一般设5~8个剂量组；霍恩氏法设4个剂量组。利用外源化学物LD50时设置剂量组，应依预试验结果而定一般设置5~7个剂量组即可，它即符合统计计算要求又可节省人力和财力。每个剂量组的动物数，小鼠不少于10只、大鼠6~8只、家兔4~6只7/23/202345概述—急性毒性实验经典急性毒性剂量确定与分组阴性对照组低剂量组(毒性作用明显，但没有或仅有个别动物死亡，相当于LD0)中剂量组(毒性作用明显，有50%动物死亡，相当于LD50)高剂量组(介于LD50-LD95之间)溶剂对照组阳性对照7/23/202346概述—急性毒性实验（三）急性实验目的1.测试和求出毒物的致死剂量以及其他急性毒性参数，通常以LD50（半数致死剂量）为最主要的参数，并根据LD50值进行急性毒性分级。2.通过观察动物中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量－反应（效应）关系和对人体产生损害的危险性。3.为亚慢性、慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据。4.为毒理学机理研究提供线索。7/23/202347概述—急性毒性实验（四）急性毒性实验应用：了解外源化学物对机体产生急性毒性的主要依据，是毒理学研究中最基础的工作。对于和人类生活密切接触的化学物如新的食品、药品、农药、化妆品、工业毒物等毒理学安全性评价，通常是必做的试验。是评估毒性大小的第一步工作。7/23/202348概述—急性毒性实验（五）急性毒性实验分类1.经典急性毒性实验：以死亡为其观察终点，所需实验动物数量多。概率单位法改进寇氏法霍恩法（Horn）7/23/202349概述—急性毒性实验经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。7/23/202350概述—急性毒性实验2.急性毒性替代实验：减少了实验动物数量；优化了动物实验。向3R方向发展。1）固定剂量法(fixeddoseprocedure)：不以死亡为观察终点；固定剂量。利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反应来对化学无毒性进行分级。7/23/202351概述—急性毒性实验2.急性毒性替代实验：2）急性毒性分级法(acutetoxicclassmethod)：以死亡为观察终点；分阶段实验。每阶段3只动物，根据死亡动物数，判定毒性。3）上-下移动法(up/downmethod)或阶梯法：多种观察终点；初步资料第一只动物剂量毒性反应第二只动物剂量·······7/23/202352急性毒性分级和评价我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准。急性毒性试验求出LD50(LC50)值，通过LD50值进行急性毒性分级(acutetoxicityclassification)，评价毒物的急性毒性的强弱，比较毒物的急性毒性大小。应注意急性毒性试验结束时，除报告该毒物的LD50值和急性毒性级别外，还应对中毒和死亡特征加以报告。7/23/202353急性毒性分级和评价在毒理学中为什么选用LD50作为判断化合物急性毒性的分级指标？LD50是通过对各试验组的数据进行统计分析得来的，其作为判断化合物急性毒性的分级指标的原因是：LD50代表受试群体感受性的平均情况，因而代表性好。位于剂量反应关系S形曲线中央，LD50不受两端个别动物感受性特高或特低的影响。此处曲线的坡度最大，因而LD50灵敏性高。其附近的曲线近似直线，因而LD50稳定性好。死亡比非死亡的许多效应便于准确观察。7/23/202354急性毒性分级和评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250实际无毒5000~10000~2180~>15>10007/23/202355急性毒性分级和评价我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)<1稍尝,<7滴5级(剧毒)1~507滴~1茶匙4级(中等毒)51~5001茶匙~35克3级(低毒)501~500035~350克2级(实际无毒)5001~15000350~1050克1级(无毒)>15000>1050克7/23/202356第三节局部刺激实验局部刺激实验目的是了解外源化学物对眼睛和皮肤的局部刺激作用和腐蚀作用。包括眼刺激实验、皮肤刺激和致敏实验。我国农药、化学品和消毒剂毒理学实验程序均规定局部刺激实验为必做项目。7/23/202357Draize实验由FDAJohnDraize于1944年建立。作为眼刺激和皮肤刺激鉴定实验。局限性：实验评分主观性强；结果重复性差；种属差异。7/23/202358眼刺激实验一、概述眼睛刺激性(EyeIrritation)：指眼球表面接触受试样品后产生的可逆性炎性变化。眼睛腐蚀性(EyeCorrosion)：指眼球表面接触受试样品后引起的不可逆性组织损伤。7/23/202359眼刺激实验二、试验基本原则受试样品以一次剂量滴入每只实验动物的一侧眼睛结膜囊内，以未作处理的另一侧眼睛作为自身对照；在规定的时间间隔内，观察对动物眼睛的刺激和腐蚀作用程度并评分，以此评价受试样品对眼睛的刺激作用。观察时间应能足以评价刺激效应的可逆性和不可逆性。观察时间最少72h，一般7d，但一般不超过21d；当动物出现严重和持久的痛苦迹象时，以适当的方式将动物处死；7/23/202360眼刺激实验三、实验动物及动物数量首选家兔。一般4只。如果受试样品的显著效应是可预见的，可以考虑用一只动物。如果用一只动物试验得出的结果提示受试样品有严重的刺激性和腐蚀性，则不必进行进一步的试验。如果结果相反，则至少需要3只家兔。有时，在增加动物的进一步试验中应该适当的阐明可疑反应。7/23/202361眼刺激实验四、不适宜做眼刺激实验的情况：强酸或强碱物质如pH≤2或pH≥11.5，由于其可预见的腐蚀特性，不必做本试验；已在皮肤试验中证实具有腐蚀或严重刺激毒性的物质不必进行眼刺激试验，可以推测该物质对眼睛将会引起相似的严重结果；在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生刺激性或腐蚀性的物质不必进行体内试验。7/23/202362眼刺激实验五、结果急性眼刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。7/23/202363皮肤刺激实验一、概述皮肤刺激性(DermalIrritation)：皮肤涂敷受试样品后局部产生的可逆性炎性变化。皮肤腐蚀性(DermalCorrosion)：皮肤涂敷受试样品后局部引起的不可逆组织损伤。7/23/202364皮肤刺激实验二、试验基本原则和要求1、将受试样品一次（或多次）涂（敷）于健康无破损的皮肤上，并作自身对照（除非怀疑有严重的刺激/腐蚀并逐渐发展）；2、在规定时间间隔内观察和评价刺激反应的程度，并作详细的记录。3、试验前24h，将实验动物脊柱两侧毛剪去或剃掉，不可损伤表皮，去毛范围左右各3cm×3cm。24h后，选择皮肤健康完整无损的动物进行试验。不应在长有浓密岛状毛的部位进行受试样品试验。7/23/202365皮肤刺激实验二、试验基本原则4、取受试样品直接涂布在皮肤上，用二层纱布和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。试验结束后，用温水或无刺激性溶剂清除残留受试样品。5、观察时间的确定应足以观察到可逆和不可逆刺激作用的全过程，以便进行完整的评价，一般不超过14d。7/23/202366皮肤刺激实验三、实验动物和饲养环境首选健康成年白色家兔，其次为白色豚鼠。如果使用其他的哺乳动物做试验，试验者应提供选择的依据。至少需要4只健康成年动物（雄性和/或雌性均可），每只动物相邻的未处理的皮肤可作为对照。实验动物应单笼饲养，试验前动物要在动物实验室中至少适应3d时间。实验动物和动物实验室应符合国家相应规定。常规饲料喂养，自由饮水。7/23/202367皮肤刺激实验四、不适宜做皮肤刺激实验的情况：强酸或强碱物质如pH≤2或pH≥11.5，由于可预见其腐蚀特性，不必做本试验；在充分并公认的体外试验结果中确定可能产生腐蚀或刺激毒性的物质不必进行体内试验。如果从受试样品的结构活性构效关系可以预见潜在的腐蚀毒性，则不必做本试验。若已知受试样品有很强的经皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物质（系统毒性）不必进行本试验；在急性经皮毒性试验中染毒剂量达2000mg/kgbw时仍未产生皮肤刺激体征的物质。7/23/202368皮肤刺激实验五、结果急性皮肤刺激试验结果从动物外推到人的可靠性很有限。白色家兔在大多数情况下对有刺激性或腐蚀性的物质较人类敏感。若用其它品系动物进行试验时也得到类似结果，则会增加从动物外推到人的可靠性。试验中使用封闭式接触是一种超常的实验室条件下的试验，在人类实际接触化学品过程中很少存在这种接触方式。7/23/202369眼和皮肤刺激试验的替代一、离体细胞、组织器官模型指利用废弃的离体动物眼球、角膜作为眼刺激试验材料替代整体动物的试验。目前开展的主要有离体鸡眼试验(chickenenucleatedeyetest,CEET)、离体兔眼试验(isolatedrabbiteyetest,IRE)、牛角膜混浊与渗透力(bovinecornealopacityandpermeability,BCOP)影响试验体外细胞培养：人角朊细胞,以避免不同种属之间结果外推的不确定性。皮肤成纤维细胞培养皮肤组织培养7/23/202370眼和皮肤刺激试验的替代二、绒毛膜尿囊膜(chorioallantoicmembrane,CAM)试验

绒毛膜尿囊膜是鸡胚外的循环系统,与眼结膜组织结构相似，是眼刺激性试验替代方法中广泛使用的模型之一。目前研究的主要有鸡胚绒毛膜尿囊膜(hen’segg2chorioallantoicmembrane,HET2CAM)试验、绒毛膜尿囊膜-台盼蓝染色(chorioallantoicmembrane-trypanbluestraining,CAM-TBS)试验绒毛膜尿囊膜血管试验(chorioallantoicmembranevas-cularassay,CAMVA)。7/23/202371皮肤致敏实验一、概述皮肤致敏反应/过敏性接触性皮炎(SkinSensitization/AllergicContactDermatitis)：是皮肤对一种物质产生的免疫源性皮肤反应。对于人类这种反应可能以搔痒、红斑、丘疹、水疱、融合水疱为特征。动物的反应不同，可能只见到皮肤红斑和水肿。7/23/202372皮肤致敏实验二、试验基本原则1、诱导接触(InductionExposure)：指机体通过接触受试样品以达到诱导产生致敏状态目的的试验性暴露；诱导期(InductionPeriod)：指机体通过接触受试样品而诱导出过敏状态所需的时间；2、激发接触(ChallengeExposure)：机体接受诱导暴露后，再次接触受试样品的试验性暴露，以确定皮肤是否会出现过敏反应。7/23/202373皮肤致敏实验二、试验基本原则3、实验动物通过多次皮肤涂抹诱导接触受试样品10～14d（诱导期）后，给予激发剂量的受试样品，观察实验动物，并与对照动物比较对激发接触受试样品的皮肤反应强度。7/23/202374皮肤致敏实验三、实验动和饲养环境首选健康、成年的白色豚鼠，体重250～300g。如选择其它种属，试验者需提供选择的依据。7/23/202375第四节短期、亚慢性和慢性毒性实验（一）基本概念蓄积作用(accumulation)：当化学物与机体发生亚慢性接触，将反复进入机体，而且当进入的速度或总量超过代谢转化与排出的速度或总量时，化学物就有可能在机体内逐渐增加并贮留的现象7/23/202376短期、亚慢性和慢性毒性实验蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础

一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准时安全系数的一种依据。7/23/202377短期、亚慢性和慢性毒性实验物质蓄积(materialaccumulation)：实验动物反复多次接触化学物后，用化学分析方法能够测得机体内存在该化学物或其代谢产物。功能蓄积(functionalaccumulation)：有的化学物在长期接触后，机体内虽不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作用。7/23/202378短期、亚慢性和慢性毒性实验功能蓄积可能是

由于贮存体内的化学物或其代谢产物的数量极微，不能检出物质的蓄积。或者是由于每次机体接触化学物之后所引起的损害累积所致。7/23/202379短期、亚慢性和慢性毒性实验（二）、概念短期（重复剂量）毒性：是指实验动物或人连续接触外源化学物14~30天所产生的中毒效应。亚慢性毒性(subchronictoxicity)：是指实验动物或人连续较长期接触外源化合物所产生的中毒效应。1~3个月。慢性毒性作用(chronictoxicity)：是指实验动物或人长期（甚至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。3个月以上。7/23/202380短期、亚慢性和慢性毒性实验研究目的1.观察长期接触受试物的毒性效应谱，毒作用特点和毒作用的靶器官。了解其毒性机制。2.观察长期接触受试物毒性作用的可逆性.3.研究重复接触受试物毒性作用的剂量一反应（效应）关系，从初步了解到确定未观察到有害作用的剂量(NOAEL)和观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)，为对该受试物的危险性评价和制定安全限量提供参考值。4.确定不同动物对受试物的毒效应差异，为将研究结果外推到人提供依据7/23/202381短期、亚慢性和慢性毒性实验二、研究方法（一）实验设计实验动物受试物染毒方法和染毒期限染毒剂量和分组效应观察结果统计和描述讨论和评价（二）长期毒性实验的注意事项7/23/202382短期、亚慢性和慢性毒性实验（三）、结果评价：应全面、综合、科学分析1.剂量相关趋势2.反应重现性3.相关指标变化4.性别差异5.差异大小6.历史性对照作用7/23/202383ThankYou！Theend！7/23/202384重复染毒毒性实验

—实验动物实验动物的选择重复染毒毒性实验动物选择原则与急性毒性实验动物的选择原则相似：与人接近；品系纯化；易于饲养；便于操作；保障供应；易于获得。与急性毒性实验动物的主要区别在于：年龄（体重）和数量7/23/202385重复染毒毒性实验

—实验动物实验动物的选择亚慢性毒性实验一般要求选择两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。7/23/202386重复染毒毒性实验

—实验动物

亚慢性毒性试验

年龄：大鼠80~100g狗8~12月小鼠10~15g数量：小动物≥20

大动物≥6性别：雌雄各半

慢性毒性试验年龄：大鼠初断乳(出生后3~4周);50~70g小鼠初断乳(出生后3周);10~12g狗<8月数量：小动物≥40大动物≥8性别：雌雄各半亚慢性、慢性毒性试验实验动物年龄应较小；数量应较大。7/23/202387重复染毒毒性实验

—染毒途径亚慢性毒性试验接触外源化学物途径的选择，应考虑两点：1.尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式2.应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种7/23/202388重复染毒毒性实验

—染毒途径慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触染毒途径经口染毒小动物常采用灌胃法，大动物常采用灌胃法和胶囊法。经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定间歇性吸入适于工业毒物，每日吸入6～8小时连续性吸入适于环境污染物，全天性吸入。7/23/202389重复染毒毒性实验

—染毒期限慢性毒性试验期限一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年也有学者主张动物终生接触外源化学物才能全面反映外源化学物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量7/23/202390重复染毒毒性实验

—染毒期限7/23/202391重复染毒毒性实验—

剂量选择与分组亚慢性、慢性实验的剂量选择的依据：一、急性、短期毒性实验资料为依据。剂量选择的一般步骤：急性毒性试验亚急性毒性试验（28天）亚慢性毒性试验（90天）慢性毒性试验7/23/202392重复染毒毒性实验—

剂量选择与分组亚慢性一是以急性毒性的阈剂量为亚慢性试验的最高剂量；一是以此化合物LD50的1/20~1/5为最高剂量。亚慢性试验的上限剂量，需控制在实验动物接触受试化合物的整个过程中，不发生死亡或仅有个别动物死亡，但有明显的中毒效应，或靶器官出现典型的损伤。7/23/202393重复染毒毒性实验—

剂量选择与分组慢性一是以亚慢性阈剂量或其1/5~1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/50~1/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50的1/10、1/100和1/1000为染毒剂量7/23/202394重复染毒毒性实验—

剂量选择与分组亚慢性、慢性实验的剂量选择的依据：二、人群主动摄入（食品和药品）的最高剂量为依据。大鼠可用人临床拟用剂量的10、30和100倍，非啮齿类可用5、15、50倍。当预期受试物没有明显毒性时，亚慢性和慢性实验设计至少等于人拟用剂量的最大倍数，保健食品为100倍，化学药品为30倍，中药为