第五节-肉毒梭菌-食品微生物课件

第五节肉毒梭菌肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）可引起严重的毒素性食物中毒，是由肉毒梭菌产生的外毒素引起的，称为肉毒中毒。在国外，引起肉毒中毒的食品多为各种肉类、肉制品、各种鱼、豆类、蔬菜和水果罐头等。欧洲各国多为火腿、腊肠、兽肉、禽肉等引起中毒；美国则多为水果罐头；日本和前苏联因鱼制品引起的中毒较多。在我国，因肉食品和罐头食品引起中毒的较少，而因臭豆腐等引起的中毒较多。

肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素。主要作用于神经系统。潜伏期长短不一。长者几天，短者2h，一般多为12—24h。肉毒毒素主要作用于外周神经肌肉接头、植物神经末梢以及颅脑神经核，阻止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全，在临床上早期表现为瞳孔放大、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，逐渐地感觉到说话和吞咽困难，但体温正常，胃肠道症状不明显，病程一般2～3d，也有的持续2～3周。死亡率较高可达30～50%，多因呼吸困难及心肌麻痹而死，如在早期治疗及时，采取型特异血清和多价血清治疗，死亡率可降低至10～15%。

肉毒梭菌为专性厌氧菌，其分布广泛，主要分布于土壤、霉干草和人畜粪便中，在其他环境中也有分布。因此很容易在食品的加工、运输和贮藏等过程中造成污染。被污染食品中的肉毒梭菌遇到适宜条件就会生长繁殖产生毒素。遇到不良环境会产生芽孢，不易消灭，而造成食物中毒。（二）培养特性本菌为专性厌氧菌，对营养要求不高，在普通琼脂培养基上生长良好，最适生长温度为28～37℃，pH为6.8～7.6，产毒的最适pH为7.8～8.2。本菌在血清琼脂上培养48～72h形成中央隆起、边缘不整、灰白色、表面粗糙的绒球状菌落，培养4d，直径可达到5～10mm；在血液琼脂上的菌落周围有溶血圈；在普通琼脂上形成灰白色、半透明、边缘不整齐、呈绒毛网状、向外扩散的菌落，直径约为3～5mm。在肉渣肉汤中，呈均匀混浊生长，其中肉渣可被A、B和F型菌消化溶解成烂泥状，并变黑，产生腐败恶臭味，3d后菌体下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基中生长可产生大量气体。血平板上肉毒酸菌菌落（三）生化特性生化特性不规律。一般可分解葡萄糖、麦芽糖、果糖产酸产气。蛋白分解能力强，对明胶、凝固血清、凝固卵白均有分解作用。本菌不能产生靛基质，可产生硫化氢。本菌因各菌型、菌株的不同，生化特性差异很大。（四）抵抗力其繁殖体与其它无芽孢菌相似，加热80℃,30min或100℃10min即可杀死。但其芽孢的抵抗力特别强大，是病原菌中抗热力最强的一个菌种，可耐煮沸1～6h，180℃干热5～15min、120℃高压蒸汽灭菌10～20min。它在酒精中可存活2个月以上。其中A、B两型的芽孢抵抗力最强，E型抵抗力最弱，80℃20min或90℃5min即可杀死。本菌产生的肉毒毒素抵抗力也较强，80℃30min或100℃10min才能完全破坏，正常胃液和消化酶于1d不能将其破坏，因此可在胃肠吸收而引起中毒。（五）菌型和毒素根据肉毒梭菌在生化反应及毒素血清学上的不同，可将目前已知的肉毒梭菌分为A、B、C、D、E、F、和G七个型。其中C型又可分为Cα和Cβ两个亚型。引起人体中毒的主要是A、B、E三型，F、G型在个别地区人的病例中有报道，C、D型主要引起畜禽中毒。各型肉毒梭菌可产生相应型的毒素，即肉毒毒素A、B、C（包括Cα和Cβ）、D、E、F和G七型，各型毒素的抗原性不同，因此其毒素只能被相应型的抗毒素所中和，但只有Cα抗毒素能中和Cα和Cβ型毒素，而Cβ抗毒素，不能中和Cα毒素，只能中和Cβ型毒素。肉毒毒素化学性质为蛋白质，目前已将A型毒素精制成结晶纯品，它是由19种氨基酸组成的、分子量为90万的球蛋白，其是目前已知化学毒物和生物毒素中毒性最强的一种。其毒力比氰化钾强一万倍。对人的最小致死量为10-7g，1g精制毒素可杀死体重20g的小鼠200亿只。

二、食品中肉毒梭菌及其毒素的检验食品中肉毒毒素检验或肉毒梭菌的检验，均以毒素的检测及定型试验为判定的主要依据。根据国家标准《食品卫生检验方法微生物学部分》的肉毒梭菌及肉毒毒素检验的方法进行检验。检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌，产毒和毒素检测试验，以证明有无毒素以及有何型肉毒毒素存在。对增菌产毒培养物，一方面做生长特性观察，同时进行肉毒毒素产生情况的检测，其结果可证明检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。（一）肉毒毒素的检测液体检样可直接离心，固体和半固体检样需加一定量的明胶磷酸盐缓冲液均质后离心，取上清液进行检测。另取部分上清液，调整其pH为6.2，按9∶1比例加入10%胰酶（活性为1∶250）水溶液，混匀，不断轻轻搅动，于37℃作用60min进行检测。本毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准检验方法。1.检出试验取上述离心上清液及胰酶激活处理液分别注射小白鼠各2只，每只0.5ml，观察4d。注射液中如有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病死亡。主要症状为竖毛、四肢瘫软、呼吸困难呈风箱式，腰部凹陷，最终死于呼吸麻痹。如小白鼠猝死，症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。

2.确证试验上述检出试验阳性者，需再做确证试验。方法如下：取样3份，1份加等量多型混合肉毒抗素诊断血清，混匀，37℃作用30min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可。将这三份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5ml，观察4d，若注射加抗血清与煮沸处理的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射未经其它处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在。3.毒力测定取已证明含有肉毒毒素的检样离心，取上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成5倍、50倍、500倍、5000倍的稀释液，分别注射小白鼠各2只，以每只0.5ml，观察4d。根据死亡情况，计算出每毫升检样中大约含有肉毒毒素的强弱。4.定型试验按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样稀释至所含毒素的毒力约在10～1000LD50.ml-1范围内，分别与各单型肉毒抗毒素诊断血清等量混匀，37℃作用30min,各注射小白鼠2只，每只0.5ml，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液注射小白鼠作对照。能保护小白鼠免于发病死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。（二）肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）取疱肉培养基3支，煮沸10～15min后，第一支急速冷却，接种检样均质液1～2ml；第二支冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却；第三支接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同前，阳性者证明检样中有肉毒梭菌存在。（三）分离培养选取含有肉毒梭菌的增菌产毒培养物接种到卵黄琼脂平板上，35℃厌氧培养48h。本菌在此培养基上生长时，菌落及其周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠层样）薄层，但G型菌无此现象。依菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种疱肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。毒素检测等方法同前，而培养特性检查是将其接种于卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落。麦当娜汤姆克鲁斯

第六节副溶血性弧菌

副溶血性弧菌又称致病性嗜盐菌（VibroParahaemolyticus）也是常见的引起食物中毒的病源菌。本菌引起的中毒多发生在沿海地区，以夏季发生多见，这主要是一些海产品或其他产品中含有很多副溶血性弧菌，当人们食用后引起食物中毒。一般认为本菌引起的食物中毒是由于摄取带有大量活菌的食物所致，人摄入105个活菌即可引起轻度中毒，摄入量超过107个就可引起明显中毒。中毒常表现为三种类型，即由肠毒素引起的毒素型；活菌侵入肠粘膜引起的感染型以及两者共同引起的混合型。

本菌引起的食物中毒，一般发病急，潜伏期为1～24h，多为6～10h。初期临床表现：上腹部疼痛、恶心、呕吐、发热、腹泻。随后剧烈腹痛，约持续1～2d，水样便，便中有粘液和脓血。病程一般较短，及时治疗可在1d内恢复。主要病变为整个小肠的水肿性变化和轻度充血，一般不波及大肠。

本菌具有嗜盐特性，是一种分布广的海洋性细菌，在海产品上大量存在，其它产品如肉类、禽类等食品以及淡水鱼中均有本菌存在。本菌繁殖速度快，9～12min就可繁殖一代。因此，污染本菌的食品遇到适宜条件，可迅速繁殖达到引起人们中毒的数量。引起本中毒的食品主要是海产品，其次是畜禽肉、蛋类食品。据调查，在本菌引起的食物中毒的病例中，海产品占65%，畜禽肉、蛋占35%。而肉类食品中盐腌食品占一半以上。本病多集体发生，海产品中毒多为爆发型。本中毒在世界各地均有发生。04年5月苏州一次婚宴引起中毒。

一、生物学特性（一）形态和染色特性

本菌为多形态，表现为杆状、稍弯曲的弧状，有时呈棒状、球状或球杆状等。本菌无芽孢，有单鞭毛，能活泼运动。革兰氏染色阴性。染色时，一般菌体呈两极浓染，中间淡，甚至无色，大小约0.6～1.0μm，有时菌体呈丝状，长度可达15μm。本菌在不同培养基上生长，其菌形态差异很大，排列也不规则，多为单在，偶有成双排列。在S·S琼脂上主要呈长卵圆形，两端浓染，中间淡染或不着色，少数呈杆状。在血液琼脂上多为卵圆形，少数为球杆状，偶见长丝状。在嗜盐菌培养基上主要呈两头小中间略宽的球杆状。在罗氏双糖培养基上24h培养物菌体基本一致，而48h培养物则形态不一、变化很大，呈球形、丝状、杆状、弧状或逗点状等，而且大小及染色特性差异都很大。在血琼脂上厌氧培养经48h后菌体呈细短杆状及球杆状菌，菌体着色均匀，不呈两极浓染。（二）培养特性本菌为需氧和兼性厌氧菌，但在厌氧时生长非常缓慢。对营养要求不高，在普通琼脂或蛋白胨水中均可生长。最适生长温度为37℃，pH值为7.7～8.0。本菌在固体培养基上，通常长成圆形、隆起、表面光滑、湿润的菌落。但多数菌株在继续传代后，出现有不正圆形的，粗糙型菌落，菌落呈灰白色半透明或不透明。本菌在肉汤和蛋白胨水等液体培养基中均匀混浊生长，可形成菌膜，厌氧情况下需经48h以上才见生长。

本菌在伊红美蓝琼脂上不能生长。有些菌株在麦康凯琼脂上也不能生长，有些菌株可生长形成圆形、平坦、半透明或混浊略带红色。在血液琼脂上有些菌株形成介于β与α之间的溶血特性。本菌在无盐培养基中不生长，含0.5%盐时可生长，培养基中的最适盐浓度为3.5%。（三）生化特性本菌能分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蕈糖、淀粉、甘油和阿拉伯糖产酸但不产气，不发酵乳糖、蔗糖、木糖、卫矛醇等。不产生靛基质，不产生硫化氢，液化明胶，能还原硝酸盐为亚硝酸盐，细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和磷脂酶均为阳性，尿素酶阴性。MR试验阳性，V-P试验阴性，赖氨酸试验阳性，精氨酸试验阴性。表11-3副溶血性弧菌和其它类似菌的鉴别──────────────────────────────────项目副溶血性弧菌溶藻性弧菌其它类似弧菌──────────────────────────────────耐盐性0%———3%＋＋＋7%＋＋d9%＋＋—11%—＋—V—P反应—＋—醋酸盐＋＋—/＋纤维二糖——＋/—阿拉伯糖＋/——＋/—甘露醇＋＋d蔗糖—＋（—）乳糖——（＋）扩散生长—＋d溶血性＋/——──────────────────────────────────注：“＋”阳性；“—”阴性；“＋/—”多数阳性；“—/＋”多数阴性；“（＋）”迟缓阳性；“d”有不同的生化特性（四）抵抗力本菌的抵抗力不强，经75℃5min，90℃1min死亡，1%醋酸1min可致死。在淡水中生存不超过2d，但在海水中能存活47d以上。本菌对四环素、氯霉素、金霉素敏感。（五）抗原结构本菌具有耐热的O抗原、不耐热的K抗原和H抗原三种，经过凝集试验将O抗原分为12个“O”群和70个“K”型，多数菌具有相同的H抗原，H抗原又称不耐热抗原，经加热100℃30分钟就被破坏。通过对副溶血性弧菌进行免疫及抗原分析，利用吸收试验，将O抗原分成28个因子，1因子是共同因子，2～27因子经吸收试验可作单因子血清，2～27因子只占总数的2.1%，2～16因子血清能与绝大部分不同来源的菌株发生凝集。二、食品中副溶血性弧菌的检验本菌主要污染海产品，特别是夏秋季节要注意对本菌的检验。检验方法按国家标准《食品卫生检验方法微生物学部分》的副溶血性弧菌检验方法进行。（一）分离培养将检样接种于氯化钠蔗糖琼脂平板和S.S琼脂平板各一个，同时接种嗜盐增菌液一管，经37℃培养8～16h，再接种上述平板，培养24h后进行观察，在氯化钠蔗糖琼脂平板上的菌落较大，呈绿色，无粘性，不易挑起。用接种环挑取3～5个可凝菌落，接种于3.5%氯化钠三糖铁培养基，于37℃培养24h可见底层变黄，上层斜面不变色，有运动性，且不产生硫化氢者可做为可疑培养物进行涂片、染色和镜检，观察形态和染色特性，并进一步做嗜盐试验和其他生化试验进行鉴定。（二）嗜盐试验将可疑培养物接种于无盐水及7%、11%的氯化钠胨水中，于37℃培养观察在不同盐浓度下的生长情况，在无盐及11%盐胨水中不生长，在7%盐胨水中生长良好者，可继续进行下列试验。（三）生化试验将可疑的培养物按其生化特性进行下列试验：糖发酵试验、靛基质试验、MR试验、V-P试验、硝酸盐还原试验、硫化氢试验及溶血试验等，以便进一步与其他类似菌进行鉴别。（四）动物试验将符合上述各类反应结果的副溶血性弧菌接种于3.5%氯化钠胨水中，培养18h后，给小鼠腹腔注射0.3ml，观察2～3d，将死亡小鼠进行剖检并做分离培养。测定菌株的毒力，要按不同剂量0.3、0.1、0.03、0.01ml接种小鼠腹腔，每一剂量接种3只小鼠，观察并记录小鼠发病及死亡情况，计算出该菌的最小致死量和半数致死量（或感染量）。第七节变形杆菌属变形杆菌（Proteus）引起的食物中毒是一种常见的细菌食物中毒，多因食入污染有变形杆菌的熟食肉类或凉拌菜及吃病死畜禽肉而引起。本菌引起食物中毒的原因主要有两种：一种是因变形杆菌随食物进入胃肠道，并在小肠中生长繁殖引起感染过程，并产生肠毒素，引起中毒性胃肠炎。另一种是因摩根变形杆菌（Proteusmorgenii）能产生很强的脱羧酶，使食品中的组氨酸脱酸形成组胺，而引起过敏型中毒。胃肠炎型中毒主要表现为潜伏期短，多为3～15h，最短者仅1h，临床症状为恶心、呕吐、腹痛剧烈、腹泻、头痛、发热、全身无力等。腹泻一日可达数次至十余次，多为水样便，恶臭，少数带粘液，病程为1～3d。过敏型中毒主要表现为潜伏期30～60min，也有的短者为5min，长者数小时，主要临床症状为颜部潮红、麻疹、血压下降、心动过速等，病程多在12h内，水产品引起的中毒多数此类。有时也会呈混合型中毒症状，即过敏型与胃肠炎同时出现。变形杆菌在自然界中分布极广，在水、土壤、腐败有机物及动物肠道内均有本菌存在。据调查食品的带菌率达3.8～8%，带菌率的高低与食品的新鲜程度、卫生条件和原料等都有密切关系。本菌为条件致病菌，一般对人体无害，但当食品上有大量活菌繁殖时，如食入胃肠道内，遇到适宜条件，便可引起食物中毒。因此，在样品中检出变形杆菌是无意义的，只有严重污染本菌的食品，才能引起食物中毒。所以在变形杆菌的食物中毒检查时，除了进行变形杆菌的分离鉴定外，还要测定每克食品中含有变形杆菌的最近似数。要注意变形杆菌不分解蛋白质，但能分解肽类，所以食品上既使有大量变形杆菌时，其感官上也无变化，但食入后可引起中毒。

一、生物学特性（一）形态与染色特性

本菌大小、形态不一，从球杆菌到长丝状，呈明显多形性。本菌具有鞭毛，能活泼运动，无荚膜，不形成芽孢，革兰氏阴性。（二）培养特性本菌为需氧或兼性厌氧菌，对营养要求不高，在普通琼脂上生长良好，在固体培养基上普通和奇异变形杆菌常扩散生长，形成一层波状薄膜，称为迁徙生长现象。如在培养基中加入0.1%石炭酸或硼酸，或将琼脂浓度提高至6%，或培养温度提高至40℃，可抑制其扩散生长而得到单个菌落。本菌生长温度为20℃。在SS琼脂上形成圆形、扁平、半透明的无色菌落，易与沙门氏菌混淆。本菌溶血，在肉汤中均匀混浊生长，表面可形成菌膜。变形杆菌革兰氏染色（1000）变形杆菌迁徙生长（三）生化特性

本属菌苯丙氨脱羧酶为阳性。可发酵葡萄糖产酸及少量气体，不发酵左旋伯胶糖、糊精、卫矛醇、肝糖、菊糖、乳糖、山梨醇和淀粉，对果糖、半乳糖与甘油的发酵能力不一致。MR试验阳性。除奇异变形杆菌外，都产生靛基质，能在KCN培养基上生长。各种变形杆菌和普罗维登斯菌的生化特性鉴定如表所示。

表变形杆菌族生化特性鉴别表────────────────────────────────项目普通奇异摩根氏雷极氏普罗菲登斯菌变形杆菌变形杆菌变形杆菌变形杆菌────────────────────────────────甘露醇———＋—麦芽糖＋————木胶糖＋＋———硫化氢＋＋（＋）——明胶＋＋———吲哚＋—＋＋＋尿素＋＋＋＋—枸橼酸盐———＋＋鸟氨酸脱羧酶—＋＋——V—P实验————