外源基因在真核细胞中的表达课件

外源基因在真核细胞中的表达WoundCrowngalltumoAtumefaciens外源基因在真核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达WoundCrowngalltumoAtumefaciens基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作为宿主,以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主,如酵母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体,不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到受体植物,而且能把动物或微生物中存在的基因转化并整合到植物基因组中,使其在植物细胞中表达。外源基因在真核生物细胞中的表达,对于分子生物学理论研究,对真核生物基因表达调控的探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。外源基因如何才能转入真核细胞?又如何能从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞?又是如何对转化的真核生物进行鉴定?基因的体外重组和表达体系最早是利用大肠杆菌作为宿主,以后逐渐发展到真核生物细胞作为宿主,如酵母、植物细胞和动物细胞等。以植物细胞作为转化受体,不仅能把一些植物基因或DNA片段作为外源基因转化到受体植物,而且能把动物或微生物中存在的基因转化并整合到植物基因组中,使其在植物细胞中表达。外源基因在真核生物细胞中的表达,对于分子生物学理论研究,对真核生物基因表达调控的探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。外源基因如何才能转入真核细胞?又如何能从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞?又是如何对转化的真核生物进行鉴定?选择标记基因和报告基因基因转化的选择标记选择标记一般是一种基因,即选择标记基因,他在转化前与待转化外源基因相连接,当把已转化和未转化的细胞群体置于加有选择剂的(抗生素)的培养基上进行培养时已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因,该基因的产物--酶能分解培养基中加入的选择剂,因此,转化细胞对选择剂具有抵抗能力,不受选择剂毒害而正常地生长,发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择剂的毒害,而不能存活下来而被淘汰(1)新霉素磷酸转移酶(氨基葡萄糖苷磷酸转移酶,neomycinphosphotransferaseⅡ,NptⅡ)NptⅡ基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生素(如新霉素,庆大霉素,卡那霉素和G-418)的O-磷酸化使抗生素失去对细胞的毒性,这是由于磷酸化的抗生素不能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合,进一步影响70S起始复合体合成,干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物合成,使植物细胞最终死亡,因此,与外源基因结合的Npt基因转化细胞后,就可在含有抗生素的培养基上存活下来(2)二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase,Dhfr)二氢叶酸还原酶为真核细胞核苷酸合成所必需,而氨甲喋呤(methotrexate,MTX)作为竞争性抑制剂抑制Dhfr酶的活性,当培养基中存在MTX时,则由于植物细胞中不能合成四氢叶酸而抑制生长有一种Dhfr的突变酶,它与氨甲喋呤的亲和力较正常酶降低260倍,突变酶不为MTX所抑制,抗MTX,将编码该酶的基因与CaMV35S启动子拼接后导入植物细胞,则转化植物细胞能在含有MTX的培养基上正常生长。相反,未转化植物细胞,其Dhfr对培养基中的MTX十分敏感,而不能存活(3)潮霉素磷酸转移酶(hpt)潮霉素B作为一种抗生素对大多数植物均有毒性,但当潮霉素B被细菌中分离到的潮霉素磷酸转移酶催化而磷酸化时,其毒性丧失。利用这一特性,可以把hpt作为选择标记,即把htp基因和适合植物的强启动子构建成嵌合基因,转化受体植物,转化有ht基因的植物细胞能表达出潮霉素磷酸转移酶,使培养基中的潮霉素B磷酸化而失去毒性,反之,未转化该基因的细胞则被潮霉素毒害致死除了以上3种常用的选择标记基因之外,还有庆大霉素抗性基因,链霉素抗性基因等抗生素类选择标记,此后,又发展出非抗生素选择标记,如抗草甘膦类除草剂基因等2.报告基因报告基因是指用于检测组装的嵌合基因在导入细胞后是否具有功能的一种指示基因,它通常是编码在离体条件下易于检测的酶具体是将报告基因连接在待研究的目的基因的启动子的下游,其后再连接真核生物的终止信号,然后将构建的融合基因转化受体细胞,组织,获得转基因植株。在转基因植株生长发育的不同阶段,不同器官和组织乃至细胞分析其中的报告基因产物-酶活性,从而了解该目的基因在何时、何处表达作为报告基因,其表达产物及产物的类似功能在未转化细胞中原本并不存在。(1)β-葡糖醛酸糖苷酶(β-glucuronidasegene,Gas)us基因是编码β-葡糖醛酸糖苷酶的基因,最初为细菌中分离的uidA基因,后被应用于植物细胞转化,Gus基因的广泛应用,一方面是其测定方法简单、灵敏、植物内源背景活性低。另一方面是由于它既可以通过荧光分光光度计进行定量分析,又可以进行组织化学染色定位。荧光法测定β-葡糖醛酸糖苷酶的活性,一般用于测定Gus基因在原生质体中的瞬间表达,或测定Gus基因在稳定完整细胞中的表达。测定时以4-甲基伞形酮葡萄糖苷酸(4-methyumbelliferyl-β-Dglucuronide)为底物,在(us酶催化下,生成4-甲基伞形酮和β-D葡萄糖醛酸。当4-甲基伞形酮的羟基解离后可被365η波长的光激发,从而产生455mm荧光,在荧光分光光度计上进行定量分析原位组织化学定位应用于对稳定转化植物进行Gus融合基因时空表达模式的精确分析,方法是用X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚β葡糖醛酸,5-bromo-4-chloro-3indolyl--D-glucuronicacid)作为底物,把待检测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温,在组织、细胞、原生质体被Gus转化的部位,Gus酶切割葡萄糖醛酸部分产生无色的吲哚氧基中间产物,随后经氧化二聚作用形成5,5溴-4,4·二氯靛蓝的蓝色沉淀,经显微镜镜检,