现代组织化学技术组织化学课件

现代组织化学技术组织化学与细胞化学1编辑版ppt1.什么是组织化学与细胞化学技术？------介于细胞生物学、组织学、化学、生物化学、免疫学及分子生物学之间的边缘科学------对组织与细胞的化学成分或者酶活性进行定性、定位和定量的研究。常统称为“组织化学”------在保持组织或细胞基本不改变其生活状态时的微细结构的条件下，利用某些特异性的反应，采用显微镜技术观察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定性、定位和定量及其变化规律Histochemistryandcytochemistry一、绪论2编辑版ppt2.组织化学与细胞化学技术的特点H­E染色H­E染色普通组织学技术：组织原位，染色，显微镜观察一、绪论3编辑版ppt组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察——对组织或者细胞内特定物质进行定性，定位，定量分析

组织化学与细胞化学技术铅法（ATP酶）2.组织化学与细胞化学技术的特点一、绪论PAS法显示粘多糖4编辑版ppt3.组织化学与细胞化学技术的主要类型(1)一般组织化学与细胞化学(2)免疫组织化学与细胞化学(3)原位杂交组织化学*每种均有光镜和电镜之分和定性与定量之分一、绪论化学方法，类化学方法，物理学方法，显微烧灰方法，免疫学方法，分子生物学方法等常用分类：5编辑版ppt4.组织化学与细胞化学技术的基本要求一、绪论保持组织和细胞的完整性被检物质具有不溶性和（或）可视性反应具有特异性反应具有灵敏性可重复性6编辑版ppt1.取材（drawmaterial）(1)组织标本取材：准备充分、麻醉或处死方法合适、操作迅速、刀应锐利、适当清洗、离体即固定（或冷冻切片，或保存于-80℃冰箱）、大小适中（约2.5cm×2.5cm×0.2cm，宁可面积大，不能厚）(2)细胞标本取材：涂片法：培养的悬浮细胞，人体液中的细胞等，细胞密度低时可先沉淀或者离心；爬片法：贴壁生长的培养细胞；印片法：活组织标本、尸检标本及子宫颈外口等脱落细胞二、标本的制备7编辑版ppt2.固定（fixation）(1)固定的目的：保持组织细胞原有的形态结构；使组织硬化；对组织化学及细胞化学技术来说---保存酶活性和蛋白质的抗原性非常重要(2)固定的优、缺点：优点：使组织细胞的形态结构得到保持缺点：拟检物质反应性减弱，酶的活性易受损二、标本的制备8编辑版ppt二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点单一固定剂：交联固定剂甲醛、多聚甲醛、戊二醛等：与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白分子相互交联，保存抗原于原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象出现障碍，可能部分或完全遮盖抗原决定簇，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。固定时缩短固定时间（824小时），降低固定温度（4℃）、固定后充分水洗、在免疫组织化学染色之前通过抗原修复等可提高抗原反应性。常用的有：10%福尔马林（即4%甲醛）、4%多聚甲醛（应用最为广泛）、2.5%戊二醛等戊二醛含两个醛基，对膜结构固定更好，但是形成更多的交联，对抗原活性有影响9编辑版ppt二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点单一固定剂：凝固沉淀固定剂丙酮、甲醇/乙醇、苦味酸、乙酸、三氯乙酸和氯化汞等：使组织细胞中的蛋白质、糖等物质凝固，优点是渗透力强，对抗原活性和酶活性保存较好；缺点是固定快，易使组织细胞收缩，小分子物质不容易保存，膜结构会破坏，因此对细胞结构保存不好。固定方法在4℃，30~60min为宜。其他固定剂铬酸、重铬酸钾、四氧化锇等四氧化锇：非电解质强氧化剂，与氨基酸、肽和蛋白质反应形成交联，保存微细结构作用好，对组织收缩和膨胀的影响小，电镜技术常用的固定剂10编辑版ppt二、标本的制备2.固定(3)常用固定剂的种类及特点混合固定剂：Bouin固定液、Carnoy固定液、Zamboni固定液等Bouin固定液：甲醛、冰乙酸和饱和苦味酸按一定比例混合，是常用的混合固定剂，特点是穿透力强、收缩作用小、固定均匀，缺点是该固定液偏酸性，对抗原活性有影响Carnoy固定液：冰乙酸、氯仿和无水乙醇组成，适于固定染色体、DNA、RNA、糖原和尼氏体等，组织化学技术常用Zamboni固定液：多聚甲醛、饱和苦味酸和Karasson-Schwilt磷酸盐缓冲液组成，类似于Bouin固定液，对超微结构的保存优于Bouin固定液11编辑版ppt2.固定(4)固定的方法浸渍法、灌注法、滴片法、原位法、蒸汽法和微波法等，浸渍法和灌注法用的最多浸润法：适用于临床取材的标本和小动物组织固定，做好标记，直接将组织块修整为合适大小，投入到样品体积的40倍左右的固定剂中，固定剂的种类和固定时间的长短根据情况而定二、标本的制备12编辑版ppt2.固定(4)固定的方法：灌流法：适用于动物实验中对缺氧敏感的器官，如神经系统、胃肠等取材。二、标本的制备包括推注，滴注滴注步骤(大鼠)：开胸-暴露心脏-自心尖剪开左心室-插入灌流针至主动脉弓-固定灌流针-快速注入冲洗液，剪开右心耳-先快后慢注入固定液-慢注毕，将动物装入含少量固定液的塑料袋置4ºC冰箱内静置2h后取材（或立即取材），放入固定液中进行后固定大动物多采用输液方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血固定液的输入量因个体不同而异，500～2,000毫升不等冲洗液固定液动物13编辑版ppt2.固定(5)影响固定的因素：组织块不宜过大：

组织块过大会影响固定剂的渗透固定液的量要合适：固定液的量要超过组织块大小的20倍-30倍，可在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层滤纸，保证组织块各个方向都有利于固定剂的渗入选择合适的固定剂：根据不同的组织以及后续研究方法的特点选择合适的固定剂，渗透性强，又不使组织过度收缩或者膨胀固定时间的长短：根据固定剂的种类、组织块的大小和性质、气温等不同而确定，固定时间太短，不能保持组织块的微细结构，固定时间过长，会降低组织内物质的反应活性，如酶的活性，对抗原的保存也不利(5)固定后的洗涤：根据不同情况充分洗涤二、标本的制备14编辑版ppt3.包埋（embedding）(1)包埋的目的：将某种特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物（即包埋剂）的理化特性（如由固态变液态，液态变固态等），将整个组织加以包裹，最后凝固成均匀一致的固态结构，用切片机切成极薄的切片(2)包埋剂的种类：非水溶性：石蜡、树脂、火棉胶等，包埋前必须脱水和透明水溶性：明胶、OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇的混合物）等，包埋前不需要脱水和透明二、标本的制备15编辑版ppt3.包埋(3)石蜡包埋：石蜡与水不相溶，包埋前必须脱水和透明，然后用熔化的液态石蜡对组织进行浸透，将浸透好的组织和石蜡放在室温条件下让其凝固，方便切成极薄的切片脱水（dehydration）：用脱水剂置换组织中的水分，脱水会使组织收缩、变脆，因此脱水剂的浓度由低到高，采用合适的脱水剂和脱水时间（与组织块大小和结构性质相关），最常用的为乙醇，组织比较致密可用正丁醇二、标本的制备*柔软的组织可从更低的浓度开始，脱水的容器密闭性要好，防止吸收空气中的水分16编辑版ppt3.包埋(3)石蜡包埋：透明（clearing）：脱水剂一般跟石蜡不互溶，用透明剂置换脱水剂，并使组织呈现透明状态，便于浸蜡和包埋常用透明剂为二甲苯、苯、甲苯、氯仿、正丁醇、香柏油等二甲苯透明能力强，易使组织收缩变脆，因此时间不能太长。可以经常观察透明进展。如果脱水不彻底，会出现“枣核”样的非透明区，必须返回到脱水剂中重新彻底脱水二、标本的制备17编辑版ppt3.包埋(3)石蜡包埋：浸蜡（paraffininfiltration）：使熔化的石蜡液浸入到已经透明的组织中，彻底置换掉透明剂。浸蜡选择熔点为58~60ºC的石蜡，制备免疫组织化学标本应该选用更低熔点的石蜡，更换1~2次，每次0.5~1小时*浸蜡和包埋所用的石蜡必须经过熔化后用滤纸过滤除去杂质*将组织块从透明剂中移入到液态的石蜡中时，动作要迅速，否则液态的石蜡很容易凝固，影响到浸蜡的效果二、标本的制备18编辑版ppt3.包埋(3)石蜡包埋：包埋（embedding）：将已浸蜡的组织块置入装有新熔化石蜡的包埋模具内，移出烤箱，即会迅速冷却凝固，包埋时注意将标本的切面向下，即标本的切面接触包埋模具的底面*将组织块从浸蜡中移入到包埋模具中，动作要非常迅速，否则石蜡很容易凝固，影响包埋效果*包埋的温度不能过高或者过低，普通组织学染色可以在65ºC，免疫组织化学染色不能高于60ºC二、标本的制备19编辑版ppt3.包埋(3)石蜡包埋：修块：石蜡凝固后，组织便包封在石蜡内。切片前需把包有组织的蜡块修成一定形状，并且把各个面修平，注意不能使蜡边与组织边靠得太近亦不能太远，近则不易连片，远则废切片刀。在修块时选适当的地方做标记，便于日后辨认二、标本的制备20编辑版ppt3.包埋(4)火棉胶包埋：常用于较大组织和器官的包埋，如大小脑，以及容易塌陷的器官，如眼球和胚胎器官等，对组织的收缩作用小，保持原有结构的效果好，但火棉胶包埋所需时间长，包埋的组织块不能做薄切片和连续切片火棉胶溶液配制：称取干燥的固态火棉胶，溶解于100ml的乙醚-无水乙醇（比例是1:1）配制成2%、4%、8%、16%的火棉胶液备用。火棉胶不易溶解，将其置入棕色瓶子内，经常摇动*固体状态的火棉胶和配制成液体的火棉胶，均是易燃品，因此使用过程中要避开明火*火棉胶容易吸收水分而成乳白状，在贮存和使用过程中要注意防水二、标本的制备21编辑版ppt3.包埋(4)火棉胶包埋：包埋：梯度酒精脱水，乙醚-无水乙醇浸泡24h，（不需透明）在不同浓度的火棉胶中分别浸泡24h到1周，取出后放入含足量16%火棉胶的包埋盒中硬化：继而放入干燥箱内放置24h，开启盒盖，使乙醇和乙醚挥发，包埋块逐渐硬化呈胶样，去掉包埋盒，包埋好的组织块放入70%乙醇或氯仿中24h，最后放入1:1的95%乙醇-甘油中保存备用二、标本的制备22编辑版ppt3.包埋(5)树脂包埋：以树脂作为包埋剂，包埋质地坚硬，易于制作很薄的切片。电镜水平的标本包埋常用环氧树脂，其包埋方法见《电子显微镜技术》中“超薄切片技术”，光镜水平的标本包埋常用水性树脂-甲基丙烯酸-2-羟基乙基酯包埋剂配制：分别配制浸透剂和催化剂标本固定和脱水：醛类固定剂常用，梯度酒精脱水，但是脱水可不彻底包埋：先入浸透剂，后入浸透剂和催化剂混合液中进行聚合包埋二、标本的制备23编辑版ppt4.切片（section）必须切成薄片才能染色重点介绍石蜡切片、冰冻切片和振动切片石蜡切片：优点：切片较薄，4~8µm，组织结构保存好，抗原定位准确，连续切片缺点：脱水透明及高温包埋，处理时间长，抗原活性容易受损，脂类物质等易被溶解过程：固定蜡块-调整切面-修块-调整切片厚度-切片-展片-贴片-烤片二、标本的制备24编辑版ppt4.切片（section）(2)冰冻切片（恒冷箱切片机）：优点：不用脱水透明高温包埋，处理时间大为缩短，抗原保存较好，可用于未固定的标本切片缺点：容易形成冰晶，切片较厚，10~40µm，结构清晰度不如石蜡切片防止冰晶形成的方法：高渗蔗糖溶液处理：20%-30%蔗糖•PB溶液浸泡1~3天，组织块沉底速冻：放组织块入-80ºC干冰或-196ºC液氮中速冻，或者将组织块固定在将温度已经下降到-50ºC的冻头上速冻*速冻前组织块都经过高渗蔗糖浸泡过过程：开机预冷-组织包埋（用OCT包埋组织于切片托上）-切片-贴片-干燥-保存（如长期保存可存放于-20ºC，如短期可室温放置，但防尘）二、标本的制备25编辑版ppt4.切片（section）二、标本的制备(2)冰冻切片（恒冷箱切片机）：26编辑版ppt(3)振动切片：利用振动切片机的振动，使刀片横向往复切割，将组织切成薄片优点：因组织不冷冻，无冰晶形成，染色前又避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，故能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，标本可以是经过固定的或者新鲜的（少数情况下）缺点：切片较前两种方法厚，20~400µm，结构清晰度较差二、标本的制备4.切片（section）27编辑版ppt4.切片(4)防脱片处理：A.载玻片和盖玻片的处理黏附剂的使用------蛋白甘油------铬矾明胶液：铬矾（0.05%）、明胶（0.5%）和叠氮钠（0.01%）------多聚赖氨酸：0.01~0.05%C.直接购买已经制备好的防脱片载玻片二、标本的制备28编辑版ppt5.非切片标本制备无需切片即可制成标本的制备方法，包括细胞涂片、分离组织、组织磨片、整体封存、组织铺片等细胞涂片：如血涂片组织分离标本：化学溶解法或者酶消化法组织磨片法：骨磨片整体封存标本：早期鸡胚、运动终板等组织铺片：结缔组织铺片二、标本的制备29编辑版ppt6.标本封固标本经过染色等系列处理后，需封固，即将盖玻片和载玻片粘在一起，方便照相和保存含水封固剂：甘油、甘油明胶、液体石蜡（用于整体标本的封固），Clear-Mount（不需盖玻片）优点：无需脱水，因此不导致组织收缩变形缺点：失水导致封固剂干缩，封固不牢无水封固剂：天然树胶、人工合成树胶（中性树胶）优点：封固牢固，长期保存缺点：切片必须彻底脱水和透明，可能导致组织收缩，二甲苯有毒，必须在通风橱内操作二、标本的制备30编辑版ppt7.组织芯片（tissuechip）技术又称组织微阵列，是生物芯片的一种，将千百个组织标本整齐有序的排列在固相载体上，制成缩微的组织切片，结合免疫组织化学、原位杂交等技术，对多种不同生物组织同时进行形态结构比较、基因和蛋白表达水平的定位检测优点：大样本高通量，高效性，平行性和实验误差小问题：人体标本石蜡组织库的建立，组织芯片制备的标准化，组织芯片的自动化分析二、标本的制备31编辑版ppt8.显微切割技术（microdissection）在显微状态或显微镜直视下，通过显微操作系统，从组织切片或者细胞涂片中切割分离欲研究的材料，如组织、细胞群、单个细胞及细胞内组分或者染色体等二、标本的制备激光捕获显微切割系统操作步骤A，准备组织；B，定位细胞；C，放置带有EVA膜的收集盖；D，激发激光；E，分离目的组织；F，下游实验分析非接触式激光显微切割方法-LeicaLaserMicrodissectionA，划定目标区域；B，控制激光沿切割线移动；C，目的样品通过重力收集32编辑版ppt生物燃料将无色的组织和细胞染上不同的颜色，便于显微镜观察，广泛应用于组织学和病理学等学科苏木精-伊红（HE）染色（hematoxylin-eosinstaining）染色原理：苏木精为碱性染料，使细胞核和胞质内的嗜碱性物质染成紫蓝色，伊红为酸性染料，使胞质中的嗜酸性物质染成红色或粉红色石蜡切片HE染色步骤：脱蜡（二甲苯）：充分彻底梯度酒精水化100%I-100%II-95%-80%-70%-水苏木精染色时间根据情况而变化三、常用组织学染色技术33编辑版ppt苏木精-伊红（HE）染色（hematoxylin-eosinstaining）(2)石蜡切片HE染色步骤：水洗：用自来水洗，弱碱性，加强苏木精的着色分色：将过度染色和无需染色的部分去掉，70%酒精配制的0.5%~1%盐酸处理数秒，使细胞核和细胞质显示清晰，对比明显蓝化：如果分色后染色较弱，可入0.5%~1%氨水中蓝化伊红染色：切片在0.5%~1%伊红中染色2~3分钟，自来水洗去多余的染液。伊红染色切忌过强，水洗要快速三、常用组织学染色技术34编辑版ppt苏木精-伊红（HE）染色（hematoxylin-eosinstaining）(2)石蜡切片HE染色步骤：脱水：用梯度酒精脱水，70%-80%-95%-100%I-100%II，浓度低的酒精有脱色作用，时间不能长，高浓度酒精中时间要足够，脱水要彻底透明：切片入二甲苯I、II中各10分钟，将酒精置换出，并且使切片清澈透明，切记在通风橱中操作封片及镜检：滤纸吸干组织周围的二甲苯，滴加中性树胶，盖上盖玻片，防止形成气泡，显微镜观察，切片平放，自然干燥三、常用组织学染色技术35编辑版ppt苏木精-伊红（HE）染色（hematoxylin-eosinstaining）三、常用组织学染色技术结果观察36编辑版ppt2.神经组织镀银染色将固定后的组织或切片浸于银溶液中，再用还原剂出来，使银颗粒附着在组织结构上，使之呈现出深棕色或者黑色亲银性：某些组织（如神经组织）经硝酸银处理后可使硝酸银还原，这种性质即亲银性嗜银性：有些结构（如网状纤维）不直接还原银，需加入还原剂才能显示银颗粒，为嗜银性神经纤维镀银改良法染色：(1)试剂：20%硝酸银，氨银液（硝酸银-无水乙醇-氢氧化铵），0.2%氯化金，5%硫代硫酸钠，丽春红酸性品红溶液，1%磷钼酸，淡绿液（淡绿和冰乙酸）三、常用组织学染色技术37编辑版ppt2.神经组织镀银染色神经纤维镀银改良法染色：(2)染色步骤：略(3)结果观察三、常用组织学染色技术38编辑版ppt四、常用一般组织化学技术

化学反应化学试剂

+拟检物质

反应产物沉淀（有色）

（组织切片或细胞涂片）（拟检物质所在处）

组织化学的基本原理组织原位，特异性的化学反应，显微镜观察——对组织或者细胞内特定物质进行定性，定位，定量分析

组织化学的基本特点39编辑版ppt碳水化合物组织化学技术（以PAS反应为例）碳水化合物也称为糖类化合物，常含有一个醛基或者水解后产生醛基，组织结构内以黏多糖最常见，中性黏多糖可用过碘酸-雪夫（periodicacid-Schiff，PAS）反应显示，酸性黏多糖可用阿利新蓝（alicianblue，AB）反应显示原理：过碘酸为强氧化剂，可氧化黏多糖产生游离醛基，与Schiff试剂中无色的亚硫酸品红反应，生成紫红色沉淀物，根据沉淀物的位置和颜色的强度判断黏多糖的分布部位和含量的多少，但是要注意控制好氧化时间，过碘酸的pH值以3.0~5.0为佳***固定剂不能选用醛类固定剂（尤其不能选用含两个醛基的固定剂），常用Carnoy固定液（无水乙醇-氯仿-冰乙酸）四、常用一般组织化学技术40编辑版ppt2.脂类组织化学技术（以油红O染色法为例）脂类是构成细胞结构的重要化合物，酸性脂类包括脂肪酸和磷脂等，中心脂类包括甘油三酯、胆固醇及固醇脂、类固醇及糖脂等。常用甲醛钙固定，甲醛不能直接固定脂类，但是可固定脂类周边的蛋白质，钙离子有利于保存磷脂，固定时间不宜超过10min；常用冰冻切片（为什么不能使用石蜡切片？）；油红O染色法（物理显色法中的一种）：原理：油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合形成小脂滴。染液入组织中，染料（染料在溶剂中的溶解度小于在脂类物质中的溶解度）可溶解于组织中的脂类中，使组织中的脂滴染成红色四、常用一般组织化学技术41编辑版ppt3.酶组织化学技术酶是体内特殊的蛋白质，每种酶可以催化特定的化学反应。用组织化学的方法在一定条件下加入酶的底物，底物在酶的催化作用下产生了反应产物，根据反应产物的分布及量可检测酶的分布和活性。为了不损失酶活性，审慎选择固定方法四、常用一般组织化学技术酶特异性底物+相关捕获剂

酶（孵育液内）（组织细胞内）镜下观察有色沉淀反应产物沉淀（有色）反应产物沉淀（无色）+置换剂（1）基本原理42编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）常用显示方法偶联偶氮色素法：又称偶氮色素法，用某种人工合成底物在酶作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性偶氮色素A.同时偶联法：该法是孵育液中的底物被酶分解后所产生的反应物沉淀立即与重氮盐形成重氮化合物的偶氮色素而显色B.后偶联法：该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色素而显色43编辑版ppt+OPO2CaOHOHβ-磷酸萘酚α-萘基氯化重氮盐不溶性偶氮色素N=NOH酶作用N≡NCl偶联偶氮色素法：44编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）常用显示方法金属-金属盐显示法:金、银、铜、铁、铅、钴等金属本身或其盐和化合物具有颜色，容易发生呈色反应，酶的分解产物与这些金属结合，呈现颜色A.钙-钴法：

R-PO4Na2

+H2OR-OH+CaHPO4CaHPO4Co3(PO4)2Co3(PO4)2

CoS↓（显色）CaCl2酶作用Co(NO3)2(NH4)2S（无色沉淀）45编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）常用显示方法金属-金属盐显示法:金、银、铜、铁、铅、钴等金属本身或其盐和化合物具有颜色，容易发生呈色反应，酶的分解产物与这些金属结合，呈现颜色B.铅法：R-PO4Na2+H2OR-OH+PbHPO4PbHPO4PbS

↓（显色）酶作用Pb2+(NH4)2S46编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）常用显示方法色素形成法:在酶的作用下，无色的化学物质在局部形成有色的色素沉着。有四种类型A.四唑盐法：显示脱氢酶C6H5—CN—N—C6H5N＝N—C6H5酶作用+2HC6H5—CN—NH—C6H5N＝N—C6H5+HCl四唑盐(无色)甲月朁

（红色）47编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）常用显示方法色素形成法:在酶的作用下，无色的化学物质在局部形成有色的色素沉着。有四种类型，B.靛酚蓝法：检测氧化酶C.靛蓝形成法：显示磷酸酶和酯酶等D.联苯胺色素法：主要用于证明过氧化物酶，过氧化物酶作用于过氧化氢，释放出原子氧，后者将无色的联苯胺氧化成有色的多聚体沉淀物，沉淀于酶所在的部位免疫组织化学法：酶是蛋白质，可用相应的抗体检测，检测的主要是酶的表达，而不能等同于酶的活性（详见免疫组织化学技术）48编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（3）过氧化物酶组织化学技术原理：过氧化物酶作用于过氧化氢（底物），释放出原子氧，后者将无色的联苯胺（二氨基联苯胺DAB或者四甲基联苯胺TMB）氧化成多聚体有色沉淀，DAB被氧化成棕色沉淀，TMB被氧化成深蓝色沉淀，位于酶所在的部位孵育液：含DAB、Tris-HCl缓冲液及H2O2**孵育液使用前混合对照实验：加入酶的抑制剂氰化钾或者叠氮钠49编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（4）琥珀酸脱氢酶（SDH）组织化学技术原理：SDH是线粒体呼吸链的第一个酶，是三羧酸循环的标志酶，也是线粒体的标志酶，可用硝基蓝四唑盐法显示，SDH以黄素蛋白为辅基，将琥珀酸氧化为延胡索酸并释放出氢，后者将淡蓝四唑（NBT）还原为蓝色的甲月朁孵育液：含NBT，二甲基亚砜（DMSO），琥珀酸和0.1MPB缓冲液**SDH对固定敏感，最好新鲜标本经冰冻切片后，2%甲醛固定5min，如果是必须固定的组织，建议降低固定液浓度，缩短固定时间**先用DMSO溶解NBT，再加入琥珀酸和磷酸缓冲液对照实验：不加底物或者加入酶的抑制剂丙二酸盐50编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（5）酸性磷酸酶（ACP）组织化学技术原理：ACP是溶酶体的标志酶，显示方法多采用金属法中的铅法。孵育液：含乙酸盐缓冲液，蔗糖，硝酸铅，β-甘油磷酸钠**

ACP对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛固定10min**先将β-甘油磷酸钠溶解于缓冲液，后缓慢滴加硝酸铅，不停搅拌，或者将前面三项物质混合溶解，少量多次逐渐加入β-甘油磷酸钠，孵育液过滤后使用，注意pH值对照实验：孵育液中加入酶的抑制剂氟化钠

R-O-PO3Na2R-OH+H3PO4

(β-甘油磷酸钠)H3PO4+Pb2+Pb3(PO4)2Pb3(PO4)2+(NH4)2SPbS↓(棕黑色)ACPpH5.051编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（6）碱性磷酸酶（ALP）组织化学技术原理：ALP在碱性环境下（pH9.2~9.4）可催化酚和醇的磷酸酯水解，并转移磷酸，多分布于细胞膜运输活跃的细胞。显示方法有钙-钴法和偶联-偶氮色素法两种。钙-钴法的原理为，碱性环境下，底物β-甘油磷酸钠在ALP作用下产生磷酸，与钙形成无色的磷酸钙沉淀，加入硝酸钴，形成仍然无色的磷酸钴沉淀，最后用硫化铵处理，形成棕黑色的硫化钴沉淀孵育液：含氯化钙，巴比妥钠，β-甘油磷酸钠，硫酸镁***

ALP对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛固定10min，***注意pH值对照实验：不加底物或者加入酶的抑制剂L-四唑咪52编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（7）乙酰胆碱酯酶（AchE）组织化学技术原理：将乙酰胆碱盐水解产生硫胆碱，进而还原铁氰化物为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜棕色沉淀孵育液：含乙酰硫代胆碱碘盐，乙酸缓冲液，柠檬酸钠，硫酸铜，铁氰化钾***对固定敏感，新鲜标本经冰冻切片后，4%甲醛固定20min对照实验：不加底物或者加入酶的抑制剂毒扁豆碱硫酸酯

碘化乙酰硫代胆碱+H2O硫代胆碱+

醋酸硫代胆碱+

铁氰化物亚铁氰化物亚铁氰化物+Cu2+亚铁氰化铜↓(棕褐色）AchEpH5.553编辑版pptL-精氨酸NADPH（介导）NOSL-瓜氨酸

+NO+电子电子NADPH（传递）硝基四唑蓝（N-BT）甲月替3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（8）一氧化氮合酶（NOS）组织化学技术对照实验：不加底物或者加入酶的抑制剂N-亚硝基精氨酸预孵育NOS是一种重要的连接酶，NO是一种神经递质、细胞间信使、内皮源性的松弛血管的介质，但是极不稳定，常用NOS的活性来判断NO的分布和量，而NOS与还原型辅酶II-黄递酶（NADPH-d）的化学结构和组织定位高度一致，常用NADPH-黄递酶法显示NOS54编辑版ppt3.酶组织化学技术四、常用一般组织化学技术（9）酶组织化学染色注意事项标本制备：组织的准备和切片的制作不能影响酶的活性和分布温度：任何酶促反应都有相应的最适温度pH值：各种酶促反应具有各自合适的pH值范围孵育液各成分的浓度：酶反应速度受孵育液内参与反应的各种成分（底物、捕捉剂、激活剂、抑制剂等）浓度的影响激活剂：激活剂是能使酶活性增强的物质。检测某些活性较低的酶时，应使用激活剂增强酶的活力抑制剂：抑制剂系指某些物质在不引起酶蛋白变性情况下，使酶活性减弱，抑制酶的活力，甚至使酶活性消失的物质。抑制剂主要分为非特异性、特异性和竞争性三类对照实验：酶的抑制剂；不加底物；阳性对照55编辑版ppt4.核酸组织化学技术四、常用一般组织化学技术（1）Feulgen反应原理：DNA在酸性环境下水解，嘌呤-脱氧核糖间的糖苷键打开，形成醛基，与无色的Schiff试剂反应，形成紫红色反应沉淀产物***不能用新鲜标本（含有缩醛磷脂，导致非特异反应），需经Carnoy固定液固定后石蜡切片；***处理时间不能过长，会导致DNA完全水解，反而不能显示***Schiff试剂中的SO2易逸出，要用棕色瓶并塞紧瓶盖低温保存对照实验：不加底物或者加入酶的抑制剂毒扁豆碱硫酸酯核酸（nucleicacid）是生物遗传物质基础，包括DNA、RNA，前者分布于细胞核，后者分布于核仁和胞质的核糖体内。主要介绍Feulgen反应和三种常用的荧光素染色法56编辑版ppt4.核酸组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）DAPI染色原理、特征及应用：特异性荧光染料DAPI（4,6-二氨基-2-苯基吲哚）对DNA双链具有很强亲和力，能与双链DNA小沟结合，结合后荧光增强20倍，而与单链DNA结合无荧光增强，与RNA结合荧光增强也不如双链DNA；DAPI具有膜通透性，可区别未经固定的活细胞（较弱的蓝色荧光）和凋亡细胞（产生很强的蓝光染色），DAPI的荧光强度较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；广泛用于流式细胞术、荧光显微镜和微孔板高通量荧光分析；因为是蓝光，可以与FITC、GFP或TexasRed等荧光染料合用进行多参数分析，DAPI也用于检测细胞培养体系中的支原体或病毒DNA57编辑版ppt4.核酸组织化学技术四、常用一般组织化学技术（2）DAPI染色DAPI储存液：0.1mg/ml溶于0.01MPBSDAPI工作液：0.1μg/ml，用0.01MPBS稀释染色步骤：培养的单层细胞(未固定)或新鲜组织的冰冻切片等，PBS漂洗5min