医学西药学课件-天然药物化学课件第二章4下载课件

（四）糖连接位置的测定1、化学方法：多采用甲基化法首先将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物—甲基化单糖—进行定性和定量分析。①定性分析：需要选择各种单糖的标准品第一课件网（）2020年10月2日1①全甲基化②水解2020年10月2日22、NMR谱法①13CNMR谱法：是目前用来确定糖的连接位置的常用方法※该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。2020年10月2日3

②1HNMR谱法：首先是使糖与苷先乙酰化，接着比较不同类型质子的化学位移值。例如：CHOAc中CH质子的化学位移为4.75~5.4ppm;而CH2OAc、CH2OR中质子的化学位移在3.0~4.3ppm；端基质子的化学位移介于这两者之间。最后通过2D-NMR就可判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。2020年10月2日4（五）糖链连接顺序的决定1、经典方法：部分水解法※过程：多糖→部分水解→低聚糖→分析低聚糖连接顺序→推测糖链连接顺序2、驰豫时间法※基本原理：外侧糖的自旋晶格驰豫时间T1比内侧大，同一糖上各碳的自旋晶格驰豫时间T1则基本相同。2020年10月2日5

3、质谱分析法※先了解糖的组成，再根据质谱裂解规律和化合物的裂解碎片推测低聚糖及其苷中糖链的连接顺序。※可解决低聚糖及其苷中糖链的连接顺序，但难于准确确定糖链的连接位置。※要求低聚糖及其苷中的糖不能是同一类糖。2020年10月2日64、现代方法：NMR与2D-NMR法

在归属各个碳原子与H原子信号的基础上，利用HMBC（异核多键相关）、NOESY（二维NOE谱）等波谱技术，通过观察相连碳氢或HH远程偶合，推断糖链的连接顺序与连接位置。第一课件网（）2020年10月2日7（六）苷键构型及氧环的确定1、苷键构型测定方法如下：⑴.分子旋光差法（klyne法）⑵.酶催化水解方法例如：麦芽糖酶只能水解α-苷键；苦杏仁酶只能水解β-苷键等。2020年10月2日8⑶1H-NMR判断糖苷键的相对构型通过C1-H与C2-H的偶合常数来判断苷键的构型.例如：D-吡喃糖，α-苷键：JH1-H2=2-4Hzβ-苷键：JH1-H2=6-8Hz2020年10月2日9⑷13C-NMR判断糖苷键的构型通过C1-H1偶合常数来判断苷键的构型.例如：D-葡萄吡喃甲苷，α-苷键：JC1-H1=170Hzβ-苷键：JC1-H1=160Hz2020年10月2日103、糖氧环大小的测定①根据13CNMR数据来判断例如：吡喃糖环中13C3-NMR信号在72-78ppm;呋喃糖环中13C3-NMR信号在80ppm以上。②分析Smith降解产物也可判断氧环的大小。③利用甲醇解反应来判断呋喃型糖甲苷与吡喃型糖甲苷色谱行为不同。2020年10月2日11二、糖链结构研究实例——皂角苷A的结构测定1、皂角苷A为无定形粉末，是九糖三萜皂苷。2、HR-FAB-MS负离子源测得分子量为：1831.7649[M-H]-3、结合13CNMR、DEPT谱确定皂角苷A分子式为：C82H128O452020年10月2日124、有关1HNMR数据：δ4.89(1H,d,J=7.3Hz),δ4.99(2H,d,J=7.6Hz),δ5.13(2H,d,J=7.1Hz),δ5.32(1H,d,J=7.7Hz),δ5.55(1H,d,J=7.3Hz),δ5.93(1H,d,J=8.2Hz),δ6.29(1H,s).第一课件网（）2020年10月2日135、有关13CNMR数据：δ94.4,δ100.9,δ103.8,δ104.2,δ104.9,δ105.5,δ105.8,δ106.2,δ106.9.※在δ100ppm处有9个吸收峰，说明皂角苷A分子结构中含9个单糖。2020年10月2日146、碱水解结果：获得一个三糖苷（次级苷）※

说明皂角苷A分子结构中通过酯苷键连有一个六糖结构。7、酸水解后，再经过气相色谱分析，结果如下：①

皂角苷A中所含单糖为夫糖、半乳糖、木糖、鸡纳糖与鼠李糖；②

各单糖相互间的分子比为1：1：4：1：12020年10月2日158、薄层酸水解后，与标准品对照证明皂角苷A中尚含有另一个单糖——葡萄糖醛酸。9、将酸水解后所得苷元再经过各种波谱数据对照证明，确认该苷元为皂树皂苷元。10、ESI-MS谱图数据①m/z1699(M--H-132)提示：木糖(M=150，150-16-2=132)为末端糖；2020年10月2日16②

m/z=955峰提示：脱掉了是一个六碳糖，在C3或C16位上连接的是一个由葡萄糖醛酸、半乳糖及木糖组成的三糖。11、对所有13CNMR、1HNMR信号进行归属

（很复杂！）①归属的依据：1HNMR、13CNMR及其1H-1HCOSY,1H-13CCOSY、NOESY等。2020年10月2日17②从表2-4可看到：A、有两个木糖E、F的端基质子化学位移值完全一样，表示这两个氢信号重叠在一起。B、有一个木糖H与鸡纳糖的端基质子化学位移值完全一样，表示这两个氢信号也重叠在一起。2020年10月2日1812、通过HMBC（异核多键相关）谱确定糖与糖的连接关系13、根据1JC1-H1、C1-H与C2-H偶合常数以及C1的化学位移值确定苷键的构型。2020年10月2日192020年10月2日20端基碳化学位移值下降-2-4-72020年10月2日21③在被苷化的糖分子结构中，通常与端基碳直接相连的α-C的化学位移变化较大些，β-C稍受影响，其他碳原子受到的影响则较少。④在确定了苷中糖的种类以后，将苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较，利用苷化位移规律可确定苷中糖的连接位置。2020年10月2日22例如：判断双糖苷中两单糖的连接位置◆将双糖苷的13C谱数据与相应单糖的13C谱数据进行比较；◆如果内侧糖的某个碳原子的化学位移向低场方向移动了（通常是4~7ppm),而与其相邻的两个碳原子之化学位移值又略向高场方向移动（约1~2ppm),则内侧糖的这个碳原子就是糖的连接位置。2020年10月2日23三、红外光谱IR1.3700～3100cm-1间有明显O-H吸收峰。2.如糖分子中含羧基、酰基等，则相应官能团的IR吸收峰可见。3.多糖在1500～960cm-1有许多吸收峰，其中970～730cm-1间的峰可用作端基碳构型判断。例如：840cm-1吸收峰——α-L-吡喃糖苷890cm-1吸收峰——β-D-吡喃糖苷2020年10月2日24四、质谱1、糖类难挥发，且热不稳定，需要制成挥发性的衍生物才能进行质谱分析。2、糖的立体异构体往往出现几乎相同的质谱，仅在碎片丰度上稍有区别（不能用质谱来区别糖的构型！）。3、糖和苷的分子量：可用CI(化学电离),FD-MS、FAB-MS等方法获得分子离子峰后测出。2020年10月2日254、软电离方式得到的碎片峰很少，但有可能获得从分子离子峰按顺序失去一个个糖基后的碎片离子峰。如果事先测定了多糖的组成，则可根据质谱的碎片离子峰信息来推断原糖链的连接顺序。2020年10月2日26第六节糖链的结构测定※主要解决四个问题①单糖的组成；②糖的氧环大小；③糖与糖之间的连接位置和顺序；④苷键构型。第一课件网（）2020年10月2日27（一）纯度测定方法1、高压电泳法※原理：由于中性多糖导电性差、分子量大、在电场中的移动速度慢，常将其制成硼酸络合物进行高压电泳。※电泳支持体：玻璃纤维丝、纯丝绸布等。※缓冲液：pH=9-12的硼砂溶液。※电压：30-50V/cm2020年10月2日28※

时间：30-120min※

显色剂：p-甲氧基苯胺-硫酸。※注意：必须使用冷却系统，将温度维持在0℃,以免烧坏支持体。※本法常用2、超离心法※原理：由于微粒在离心力场中移动的速度与微粒的密度、大小与形状有关，故将多糖2020年10月2日29溶液进行密度梯度超离心时，如果是组成均一的多糖，则应呈现单峰。※具体做法：将多糖样品制成1%-5%的氯化钠或tris-盐溶液，接着进行密度梯度超离心，待转速达到恒定后（6000转/min），采用间隔照明法检测其是否为单峰。2020年10月2日303、旋光光度法在多糖水溶液中加入乙醇使其浓度达到10%左右，离心得沉淀。上清液再用乙醇使其浓度达到20%-25%左右，离心得到第二次沉淀。比较两次沉淀的比旋光度，如果比旋光度相同则为纯品，否则为混合物。4、其他方法如凝胶柱色谱、官能团摩尔比恒定法等。2020年10月2日31（二）分子量测定1、测定多糖分子量物理方法：沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。2、凝胶过滤法简介：在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的分子量。◆该法用量小、操作较简便。2020年10月2日323、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定※最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS4、多糖分子量的测定方法①基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-MS）②基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS).2020年10月2日33（三）单糖的鉴定

1．纸层析①展开系统：常用水饱和的有机溶剂如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW②展开方式：上行、下行等③显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后引起的一些呈色反应。例如，2020年10月2日34※邻苯二甲酸苯胺※硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色）※三苯四氮唑盐试剂（单糖和还原性低聚糖呈红色）※3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂（酮糖呈红色）※过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。2020年10月2日352．薄层层析①采用（硼酸液/无机盐）+硅胶→制板②吸附剂：硅胶③显色剂：除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、苯胺-二苯胺磷酸试剂等。2020年10月2日363．气相层析①将糖制备成三甲基硅醚②醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。4．离子交换层析①原理：糖的硼酸络合物可进行离子交换层析2020年10月2日37②优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液进行分离（与气相比较）③需要仪器—糖自动分析仪5．液相色谱①填充材料——化学修饰的硅胶②优点：不必制备成衍生物。适合分析对热不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。③缺点：灵敏度不及气相层析高。2020年10月2日38◆多糖组成的鉴定1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。2020年10月2日39（四）糖连接位置的测定1、化学方法：多采用甲基化法①过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物—甲基化单糖—进行定性和定量分析。②甲基化过程：常用箱守法(Hakomori)③水解过程：通常先用90%甲